遗传验证从所选药物的指定靶点开始
抗癌药在培养细胞中有效，仍需要确定杀伤是否来自预定靶点。美国冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory）等团队在 Science Translational Medicine 选择 10 种处于临床研究或临床前研究阶段的抗癌药，利用人源癌细胞和遗传干预检查作用机制，并对其中 OTS964 继续寻找真实相关靶点。
所选药物对应 CASP3、HDAC6、MAPK14、PAK4、PBK 和 PIM1 6 种蛋白。选取条件包括曾报告有细胞自身增殖相关作用，却尚缺少能够赋予相应药物耐受的已知靶点突变。
5 个候选靶点的敲除未明显抑制细胞增殖
团队在 32 个、12 类肿瘤的细胞系中，比较靶点基因受干预的细胞与其他细胞随培养的比例变化。PCNA、RPA3 等必需基因作为阳性对照，5 次传代后相应细胞明显减少；Rosa26、AAVS1 阴性对照变化较小。HDAC6、MAPK14、PAK4、PBK、PIM1 在本组模型中均未呈现同样的细胞减少。
研究进一步建立单细胞克隆，使用识别不同蛋白部位的抗体确认靶蛋白缺失。多个背景下，敲除克隆仍增殖，并在软琼脂中形成集落；MEK1 作为已确认依赖的对照，敲除后增殖和集落形成下降。
团队检查 33 个敲除克隆的相近同源蛋白表达，没有发现一致补偿性上调；另分析 485 个细胞系的全基因组 CRISPR 数据和 712 项 shRNA 筛选，结果总体一致。四个细胞系中用 CRISPR 转录抑制（CRISPR interference，CRISPRi）降低表达，也没有显示这 5 类靶点基因的明显增殖依赖。
靶点缺失后，药物和部分 RNA 干扰仍能抑制增殖
某些既往 RNA 干扰材料仍能抑制已经敲除相应基因的细胞，提示这些材料造成的生长变化含有脱靶作用。相应药物也在靶点缺失克隆中保持杀伤：例如 PAK4 指定抑制剂 PF-3758309 对对照与 PAK4 缺失细胞的生长半数抑制浓度均约为 9 nM。
CASP3 缺失的四个细胞背景仍对 PAC-1 和 1541B 敏感。其余指定 HDAC6、MAPK14、PAK4、PBK、PIM1 的药物，也在相应敲除模型中保留毒性。所选 10 种药物在已测条件下均表现出不依赖原指定靶点的杀伤。
药物配合其他化疗药时，活力下降可以增强，但同样在靶点缺失克隆中出现。研究还直接检查 HDAC6 缺失后对紫杉醇等药物的敏感性，没有观察到既往所提出的增敏效果。团队分别检验了联合用药的效果和指定靶点的必要性。
OTS964 的耐药突变指向 CDK11
OTS964 原被描述为 PBK 抑制剂。研究从 HCT116 结直肠癌细胞分离出 12 个稳定耐药克隆，10 个用于外显子组测序，全部带细胞周期蛋白依赖性激酶 11B（cyclin-dependent kinase 11B，CDK11B）改变；另外两个也通过测序确认。耐药克隆仍对紫杉醇敏感，未出现相同的普遍多药耐受。
最一致的改变为 CDK11B G579S。将这一突变引入多个癌细胞背景，能使细胞在原致死 OTS964 条件下存活；在已耐药克隆中去掉突变 CDK11B，又恢复敏感。结合测试显示，OTS964 与 CDK11B 的解离常数（dissociation constant，Kd）为 40 nM，相对所测其他部分 CDK 有超过 10 倍的选择性。
CDK11A、CDK11B 单独受到干预时，细胞比例变化较小；同时影响两者则在多个背景下明显降低适应性。药物及相应遗传干预阻碍有丝分裂进程，G579S 可恢复药物条件下的正常分裂。耐药、恢复和直接结合三类结果共同支持 CDK11 是 OTS964 的主要细胞作用靶点。
验证范围集中于细胞自身增殖机制
作者将遗传靶点确认作为临床前药物评价的重要环节：基因缺失后是否保留杀伤、特定突变能否赋予耐药，以及药物是否直接结合相关蛋白，分别提供机制证据。错误指定原靶点也可能遮蔽真正的敏感性标志。
本研究检验的是所选细胞背景中的自主增殖和药物作用。罕见未测肿瘤、炎症及其他非细胞自主作用仍在当前范围之外。实验没有随机化或盲法；细胞竞争实验只有 1 个生物学重复，增殖实验有 2–3 个生物学重复，药敏曲线为 3–6 个技术重复。