用同一遗传背景比较两种 TARDBP 变异
药物筛选可以从细胞表型出发，也可以先寻找与疾病相关的基因表达变化。加拿大麦吉尔大学（McGill University）研究者围绕肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），在 Scientific Reports 报道了一条结合两者的路线：先分析运动神经元的转录组，再预测能够产生相反表达变化的化合物，最后用活力和放电实验检验。
团队在 1 株健康男性供者的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）中分别引入 TARDBP A382T 和 G348C 纯合变异，并保留原细胞作为同背景参照。神经元培养中还含部分中间神经元、胶质及前体细胞，相关细胞标志的表达在变异与参照组间没有显著差异。
转录组取样时间为运动神经元前体细胞重铺后的第 4 周，使用 5 次独立分化。以假发现率小于 5% 为标准，A382T 与 G348C 模型分别有 201 和 324 个差异表达基因，其中 42 个重叠；另将两种变异合并对照原细胞的分析得到 73 个差异基因。
表达谱同时记录 mRNA 和微小 RNA 变化
两种变异影响的部分基因和功能类别相近，包括离子结合、DNA 结合和转录因子相关类别。研究者另选 15 个相关基因做定量 PCR，在额外提取的 RNA 样本中确认其中 10 个基因在一个或两个模型中的表达变化。
小 RNA 测序分别发现 40 和 47 个微小 RNA（miRNA）的丰度改变，36 个在两种变异间重叠。共同下降的 35 个 miRNA 位于 14q32 基因簇。后续 PCR 检测的 7 个 miRNA 中，1 个达到显著下降，其余多表现为下降趋势。
团队用计算方法预测变化 miRNA 的靶基因，再与 mRNA 测序结果对照，找到部分丰度呈相反变化的基因。预测靶基因的功能富集结果涉及突触、细胞黏附和神经发育；与既有 ALS 数据集比较，也观察到部分基因重叠。研究者据此继续测试能够改善细胞指标的化合物。
Connectivity Map 将表达特征转为候选名单
团队把上调和下调基因列表分别输入 Connectivity Map（CMap）。数据库按化合物诱导的表达变化与查询特征的相似程度计算连接评分，范围为 −100 至 100；负分表示方向相反，因而可用于寻找可能逆转表达变化的候选。
团队先识别评分低于 −85 的 16 个优先化合物，再结合单个或合并变异数据集的评分，以及已知用途、作用机制和进入中枢神经系统的可能性，选择 6 个进入细胞实验。名单包括 MLN4924、piperlongumine、prunetin、QS-11、XMD-885 和 XMD-892。
研究者分别在撤去神经营养因子的条件下测量 ATP 活力信号，在保留营养因子的条件下记录神经元电活动，用两项实验检验计算筛选出的候选化合物。
活力实验中，两种变异的显著性不同
活力实验使用分化 5 周的神经元，候选化合物设 0.1 和 1 μM，处理 6 天、每 2 天换液。培养液撤去 BDNF、CNTF 和 IGF-1，检测采用 CellTiter-Glo 的 ATP 发光信号，并以各细胞系的溶剂组归一化。
1 μM MLN4924 使同背景参照和 A382T 模型的归一化活力分别增加 29.3% 和 28.4%，差异达到显著；G348C 模型增加 14.5%，未达显著。数值描述的是归一化 ATP 信号的变化。实验合并 4 次独立分化。
作为比较的利鲁唑、依达拉奉，以及苯丁酸钠与牛磺熊去氧胆酸组合，在本研究使用的剂量和条件下没有显示相同的活力改善。
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电活动和 NEDD8 检测补充功能验证
电活动实验保留神经营养因子，候选化合物统一使用 1 μM、处理 6 天。在多电极阵列上记录自发活动后，A382T 和 G348C 模型的平均放电频率分别增加 1.7 和 1.5 Hz，两者均达到显著。
MLN4924 抑制 NEDD8 激活酶，影响将 NEDD8 连接到蛋白底物的翻译后修饰。免疫印迹显示，处理后 NEDD8 偶联蛋白在各模型中有下降趋势，显著差异只出现在 G348C 模型；TDP-43 的 RNA 和总蛋白水平没有显著变化。
蛋白检测使用重铺后第 2 周的细胞，PCR 检测使用第 4 周细胞，两者的培养时间均早于第 5 周开始的功能筛选。研究确认了化合物对相关修饰过程的作用，但改善活力与放电的具体机制仍需研究。
转录组预测结合活力与电活动实验筛选候选药物
本研究将转录组排序、ATP 活力、多电极阵列和靶向蛋白检测接在同一筛选流程中。结果支持 MLN4924 在这些培养条件下的体外作用，也显示不同变异与不同指标的反应并不完全相同。
作者讨论了 iPSC 模型的未成熟状态、重编程后年龄相关特征的改变，以及其他细胞类型不足的影响。模型来自同一供者遗传背景的工程化细胞，表达谱与患者脊髓资料只部分重叠；后续可据此扩展细胞背景并研究药物作用机制。