AAV-RPGR 在人视网膜类器官中纠正视紫红质定位异常

用同一遗传背景建立 RPGR 缺失模型

RPGR 基因变异是 X 连锁视网膜色素变性的重要原因。英国 MeiraGTx、Moorfields Eye Hospital 与伦敦大学学院（University College London）研究人员在 International Journal of Molecular Sciences 报道，用人视网膜类器官检测 RPGR 基因补充载体能否恢复相关蛋白功能。

团队从健康来源的人皮肤成纤维细胞出发，在重编程为诱导多能干细胞（iPSC）的同时编辑 RPGR，建立带有第 10 外显子 131 bp 缺失的细胞系。未编辑的同背景细胞作为参照，两者随后分化成三维视网膜类器官。

RPGR 缺失类器官仍能形成视网膜相关细胞，表达 CRX、RECOVERIN、NRL 等标志，并出现视杆和视锥光感受器相关结构。主要异常包括 RPGR 蛋白缺失，以及视紫红质在光感受器细胞体所在的外核层异常积累。

在类器官中检测基因表达和蛋白定位

实验使用含 RPGRORF15 转基因的临床相关构建体，并将其包装在腺相关病毒（AAV）的 AAV7m8 衣壳中。研究人员选择 AAV7m8，是因为它在本研究的类器官比较中，比 AAV5 和 AAV8 更有效地转导发育中的光感受器。该包装形式用于本次体外模型测试。

类器官在分化第 135 天接受处理，随后继续培养约 25 天。研究通过定量 PCR、蛋白检测和免疫染色，分别观察 RPGR 转录、蛋白表达及亚细胞定位，并以未处理的缺失类器官和正常类器官作对照。

处理后的缺失类器官恢复了 RPGRORF15 蛋白表达。染色显示，载体产生的 RPGR 重新出现在光感受器连接纤毛处，位置与正常参照相似。视网膜相关标志基因和整体形态在所测条件下未见显著不利变化。

蛋白修饰恢复，视紫红质错位减少

RPGR 的功能还与翻译后修饰有关。团队使用 GT335 抗体检测谷氨酰化修饰（glutamylation），结合蛋白检测和共定位成像，观察载体产生的 RPGR 是否具有相应修饰特征。

未经处理的缺失类器官中，相应 RPGR 修饰信号明显减少。AAV-RPGR 处理后，RPGR 与 GT335 的共定位恢复，平均修饰水平与正常参照没有显著差异。

团队还对视紫红质定位作了定量分析。以外核层中的视紫红质阳性像素占全部视紫红质阳性像素的比例，衡量其在细胞体内的异常分布。处理组的异常积累显著低于未处理缺失组，并接近正常参照。

从蛋白表达进一步检验体外作用

这套实验把基因补充的多个环节连接起来：载体进入类器官、RPGR 蛋白恢复表达、正确定位与修饰出现，以及视紫红质运输相关表型改善。它为该构建体在人光感受器细胞中的作用提供了体外功能资料。

部分检测使用 2–6 个类器官，模型来自同一遗传背景细胞。