混合材料分别承担细胞培养和气体交换

肝芯片开发需要先解决细胞能否在流动条件下保持功能,以及材料是否便于成像、装置能否在持续灌流中保持密封。聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)具有透气性和加工便利性,但可能吸收疏水性小分子。环烯烃共聚物(cyclic olefin copolymer,COC)的低自发荧光和光学透明性适合成像,气体交换能力则与 PDMS 不同。

纳扎尔巴耶夫大学(Nazarbayev University)团队把 COC 用作下层微通道,PDMS 用作平整上盖,并在胶原包被的通道内培养人肝癌来源 Huh7 细胞。研究选择这一细胞系验证平台的培养可行性,检测细胞活性及白蛋白、尿素分泌。论文明确把药物代谢研究列为后续开发用途。

混合聚合物芯片结构、灌流配置与细胞培养界面。(Gulsim Kulsharova et al.,Polymers,2021,图 1;CC BY 4.0)

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混合聚合物芯片结构、灌流配置与细胞培养界面。(Gulsim Kulsharova et al.,Polymers,2021,图 1;CC BY 4.0)(Gulsim Kulsharova et al. / Polymers, 2021, 图 1;CC BY 4.0)

聚碳酸酯的成像和密封问题影响材料选择

研究先评估聚碳酸酯、COC 和 PDMS 对 Huh7 生长的支持情况。胶原包被改善了细胞在聚碳酸酯和 COC 表面的贴附。以聚碳酸酯作底层时,明显的自发荧光干扰了死细胞成像;连续流动实验还出现层间漏液。COC–PDMS 组合的自发荧光较低,因此被用于后续灌流实验。

上盖厚度同样影响培养结果。3 mm 厚 PDMS 上盖下的细胞在静止或流动条件下均几乎不贴附,1 mm 上盖则支持 24 小时静态培养后的细胞生长。作者推测较薄上盖改善了外界氧气进入培养区的条件;本研究没有直接测量芯片内氧浓度,氧输运模型也仍待进一步建立。

模拟分析显示填充时容易滞留空气

混合芯片在较高流速下可出现细胞脱落和可见气泡。作者因此用计算流体力学(computational fluid dynamics,CFD)模拟水进入原先含空气的腔室,分析填充过程中的空气滞留。这部分计算针对流体分布和装置使用,实验中的细胞功能另由生物指标检验。

经过网格敏感性分析的模型在 5 μL/min 填充条件下给出 18.8% 的空气体积分数;流速提高到 10 μL/min 的对应模拟为 24.5%。把计算腔室高度降至 0.5 mm 后,空气体积分数降至 15.3%。向出口方向略微倾斜时,模拟进一步得到较低的残余空气比例。实验中倾斜装置也减少了加样时的气泡,但论文没有给出与模拟相同精度的实验空气体积分数。

这些结果帮助调整细胞加载和清洗时的装置姿态。正式低流速灌流时,芯片可以水平放置,作者未见持续气泡滞留。填充模拟与培养实验解决的是不同阶段的问题:前者查找空气排出障碍,后者观察细胞能否在选定条件下维持贴附和功能。

24 小时灌流中检测白蛋白、尿素和细胞活性

细胞在通道内贴附 1 天后,培养液以 3 μL/min 持续流过芯片。研究每 100 分钟收集 300 μL 流出液,在 24 小时内检测白蛋白和尿素,各样本做重复测定。尿素检测扣除了培养液对吸光度的贡献,灌流结束时再用活死染色观察细胞。

流出液中的白蛋白平均浓度为 5.57 ± 0.24 ng/mL,尿素为 0.43 ± 0.04 mg/dL。白蛋白分泌在约 6 小时后略有上升,尿素在前期波动后趋于稳定。末次成像以活细胞为主,培养区仍有贴附细胞;流出液检查未发现明显脱落或被冲走的细胞。

流出液浓度与静态积累量需要分别理解

论文还报告静态培养 24 小时的白蛋白浓度为 189.16 ± 36.44 ng/mL。灌流中连续更换培养液,白蛋白随流出液被带走,静态培养则在原培养液中积累;两种浓度对应的收集方式不同,不能据其数值差异直接判断细胞分泌功能的优劣。

作者按细胞数、时间和样本体积归一化后,把结果与已发表的其他肝细胞培养资料比较。相关资料涉及不同细胞系和检测时点。本研究最直接支持的是:Huh7 细胞在该平台的 24 小时灌流中保持可检测的白蛋白和尿素分泌,并且末次成像显示细胞仍然存活和贴附。

药物代谢应用仍需进一步功能验证

研究完成了材料选择、气泡问题分析及短期培养可行性验证,没有测试具体药物的代谢、清除率或肝毒性。Huh7 的代谢能力也与原代肝细胞及其他肝细胞系不同。作者提出后续优化培养功能,并把平台扩展到其他肝细胞来源,再研究药物代谢。

来源与延伸阅读

  1. Development of a Hybrid Polymer-Based Microfluidic Platform for Culturing Hepatocytes towards Liver-on-a-Chip Applications. Polymers. 2021. doi:10.3390/polym13193215 ↗