在混合神经细胞中观察运动神经元损伤
肌萎缩侧索硬化症（ALS）以运动神经元退变为主要特征，患者遗传背景复杂，人源细胞模型可用于寻找具有神经保护作用的候选药物。哈佛大学（Harvard University）研究人员在 Frontiers in Cellular Neuroscience 报道，用药理工具诱导内质网应激，再在健康及家族性 ALS 的诱导多能干细胞（iPSC）模型中测试保护作用。
研究包括 1 株健康参照 iPSC，以及分别具有 TDP-43 G298S 和 SOD1 L144F 变异的 2 株患者 iPSC。细胞经 15 天分化后形成混合培养，约 80% 表达神经元标志 TUJ1，其中约 30% 还表达运动神经元标志 Isl1/2。双阳性细胞用于运动神经元分析，其余细胞另作比较。
团队使用抑制内质网钙泵的 thapsigargin 和衣霉素（tunicamycin）产生两种不同来源的应激。两者都使运动神经元较其他细胞更易损伤，作用随浓度和时间增加；健康与两种患者背景中均可观察到这一特点。另一种蛋白稳态干扰工具 MG132 在本次条件下没有产生相同的选择性损伤。
2 株 ALS 来源细胞在部分较高浓度下有更强的应激敏感趋势。由于患者细胞与健康参照的其他遗传背景也不同，作者将这种差异作为患者背景的整体表现，继续用多组细胞检查保护作用。
应激信号先出现，随后发生神经突退变
未折叠蛋白反应（UPR）帮助细胞应对内质网中的蛋白负担，持续应激可能促使细胞发生凋亡。团队在健康参照细胞中追踪应激开始后的分子变化：thapsigargin 处理约 30 分钟后，eIF2α 磷酸化增加；衣霉素的反应更慢，随后出现 XBP1 剪接，以及 BiP、CHOP 的 RNA 和蛋白变化。
持续处理 8–24 小时后，裂解型 caspase-3 和 TUNEL 凋亡信号增加，神经突退变与细胞死亡相继出现。广谱 caspase 抑制剂约能挽救一半的应激相关运动神经元损失，说明凋亡参与了损伤过程。
后续存活试验在 96 孔板中开展。每孔接种 50000 个分化细胞，恢复培养 6 天后，同时加入应激工具和待测药物，处理 48 小时。高内涵成像根据核形态、TUJ1 与 Isl1/2 染色计数存活运动神经元，并分析每个神经元的神经突。
MAP4K4 抑制改善细胞存活与神经突形态
研究先在健康参照模型中比较利鲁唑和依达拉奉。在 1 μM thapsigargin 条件下，这 2 种药物于 10 nM–10 μM 的测试范围内没有改善运动神经元存活或神经突形态。与此同时，已知神经保护工具 kenpaullone 对两种应激条件均有保护作用。
由于 kenpaullone 影响多个激酶，团队进一步测试较有选择性的 MAP4K4 inhibitor 29。该化合物与 kenpaullone 一样，在健康参照、TDP-43 及 SOD1 患者模型中提高存活，并保留神经突网络。标准保护参照浓度分别为 kenpaullone 3 μM 和 MAP4K4 inhibitor 29 5 μM。
加入保护药物提高了细胞存活率，BiP 和 CHOP 蛋白水平仍然升高。
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磷酸化蛋白组引导下一步靶点测试
机制分析在健康参照模型中开展。为在较晚时间仍保留足够细胞，团队把 thapsigargin 降至 0.1 μM，在处理后 24 和 48 小时收集样本。两次生物学重复合计识别 6697 种蛋白、2764 种磷酸化蛋白和 7999 个非重复磷酸化位点，部分位点变化按对应蛋白总量校正。
kenpaullone 引起较明显的单蛋白和神经突相关变化，MAP4K4 inhibitor 29 的单蛋白显著变化较少。研究进一步按激酶与底物关系分析整体磷酸化模式，找到两种保护条件共有的 JNK、PKC 家族及 RAF 相关变化，作为后续药物测试的线索。
团队在健康参照细胞中测试 JNK 抑制剂 SP600125、PKC 抑制剂 enzastaurin 和 BRAF 抑制剂 GDC-0879。三者均在 thapsigargin 或衣霉素应激下改善运动神经元数量与神经突形态，作用与已知保护参照相近。该组候选的剂量—反应实验以健康参照进行，患者背景中已确认的是前述 kenpaullone 与 MAP4K4 抑制剂的作用。
作者把这一体系作为可扩展的神经保护筛查工具，并提出继续研究各化合物的具体保护机制。当前结果围绕人为诱导的应激、细胞存活和神经突结构，提供了进一步测试候选靶点的实验依据。