由肾脏细胞组成的肾类器官截面概念插画。
肾类器官截面示意(NIH BioArt)。(Ryan Kissinger / NIAID Visual & Medical Arts / NIH BioArt Source;Public domain)

尺寸一致,还需要结构和功能一致

类器官药物实验中的差异,有时来自模型自身。韩国浦项科技大学(Pohang University of Science and Technology,POSTECH)等机构的团队开发 UniMat,将限定细胞聚集形状的微孔与可渗透膜结合,希望同时改善类器官的均一性和成熟度。研究以人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)衍生肾类器官为主要对象,进一步检查这种改进是否能使囊肿药物实验更稳定。

团队设置了两类对照。与无几何限制的 Geltrex 水凝胶层比较,主要检查类器官大小、足细胞及肾小管结构的差异;与尺寸相近但不透液的 AggreWell 微孔平台比较,主要检查成熟度和功能。这两个比较分别检查几何约束和物质供应对模型质量的影响。

UniMat 中类器官的直径分布和内部结构比例更一致。研究分别测量足细胞、近端小管和远端小管所占的体积比例,再检查相关基因表达。与水凝胶层相比,UniMat 中这些指标的模型间差异较小;3 个独立批次中的类器官形成效率也较稳定。

可渗透环境改善肾小管成熟度

与 AggreWell 比较时,UniMat 类器官包含更多近端和远端小管结构,近端小管出现更明确的极性。团队用葡聚糖摄取实验检查吸收功能,观察到葡聚糖进入并保留在 LTL 标记的近端小管细胞中。足细胞相关结构和多项肾单位基因表达也得到改善。

为了检验可渗透性是否重要,研究进一步比较低渗透和不渗透的 UniMat 变体。葡萄糖扩散的数值模拟与成熟度相关基因检测显示,可渗透性较高的平台具有更好的物质供应和更高的相关基因表达。前体细胞活性检测未发现 UniMat 与 AggreWell 的显著存活差异,作者据此将成熟度改善主要归因于分化过程中可溶性物质的供应。

单细胞 RNA 测序纳入了两种平台共 30,510 个细胞。在比较核心肾单位细胞的组成时,UniMat 的足细胞比例较低,近端小管及亨利袢/远端小管比例较高,更接近论文引用的人和小鼠肾单位资料。近端小管中较早期细胞的比例,在 UniMat 中为 18.7%,在 AggreWell 中为 62%,支持两种平台的成熟度差异。

血管相关结构和长期稳定性分别检查

UniMat 类器官中的 PECAM1 阳性血管相关结构面积、分支点密度和平均长度,均超过 AggreWell 对照的 2 倍。成像还显示,这些结构更常进入足细胞簇。另一个功能检测中,UniMat 类器官的血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)蛋白水平为对照的 8 倍。

长期观察延续到第 50 天,UniMat 中仍可见足细胞、极化近端小管、远端小管和血管相关结构。肌成纤维细胞标志物 αSMA 虽然也有表达,但其位置与肾单位结构相对分开。结构成像、蛋白分泌和葡聚糖摄取分别提供了不同层面的质量指标。

同样的囊肿诱导,模型间反应不同

药物实验采用 forskolin 提高细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号,诱导类器官膨大和囊肿形成。团队比较水凝胶层、AggreWell 和 UniMat 的反应;前两类模型的囊肿位置和大小差异较大,UniMat 则显示更一致的囊肿形成和浓度依赖性面积增大。这一比较采用的是以信号刺激诱导囊肿的人 iPSC 肾类器官。

随后加入研究用 CFTR 抑制剂 CFTR inhibitor-172,UniMat 来源的囊肿模型出现更一致的面积下降,而且两档处理的反应能区分。水凝胶层和 AggreWell 来源模型的面积变化仍较不稳定。面积指标采用单个处理后类器官的面积除以相应处理前组的平均面积;各处理后类器官均与同一组基线平均值比较。

论文还以肾损伤分子 1(kidney injury molecule-1,KIM-1) 检查损伤模型的一致性,UniMat 显示较稳定的浓度反应。整体结果提示,类器官内部细胞组成、成熟度和模型间差异,会一起影响药物评价结果。对药物筛选而言,培养平台的质量检查应与具体反应指标配套进行。

来源与延伸阅读

  1. Scalable production of uniform and mature organoids in a 3D geometrically-engineered permeable membrane. Nature Communications. 2024. doi:10.1038/s41467-024-53073-z ↗