细胞组成和空间梯度影响药物反应
三维肿瘤球中的药物反应，既取决于肿瘤细胞，也受到模型内部空间环境影响。美国马萨诸塞药科与健康科学大学（Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences，MCPHS）等机构的作者在 Cells 发表综述，讨论多细胞肿瘤球如何用于抗癌药物和递送系统评价，并整理模型结构与功能的检测方式。
球状体内部可形成氧、营养和代谢产物梯度，外围与中心的细胞状态因而不同。加入成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，还会改变细胞之间的相互作用及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积。作者将这些因素与药物进入模型、局部积累和细胞反应联系起来。
分析三维药物实验时，需要知道检测保留了哪一类信息。完整球状体成像能观察空间位置，解离后的单细胞检测便于比较细胞群，而整球活性信号主要反映总体变化。综述据此将形态、细胞组成、迁移、药物渗透和治疗效应分别讨论。
微流控系统还可以为肿瘤球提供持续流动的培养环境。综述介绍将血管侧、基质屏障和球状体所在区域分开的设计，用于观察递送颗粒跨越不同区域后进入模型的过程。持续供应、流动方向和暴露时间，因而能与静态培养形成不同的比较条件。
成像同时观察球体结构和局部细胞状态
明场成像适合连续观察球状体直径和形态。荧光标记则能显示增殖、凋亡、低氧等细胞状态，以及不同细胞群所在的位置。将处理前后的分布进行比较，有助于识别外围和内部是否出现不同药物反应；尺寸变化可与这些局部指标一起解释。
厚的球状体会散射和吸收光，常规宽场成像还容易叠加不同层面的信号。综述讨论了物理切片、共聚焦光学切片及更深层成像方式。共聚焦连续采集不同深度的图像，可重建内部结构；透明化、多光子和光片技术则为较厚模型提供其他选择，各自仍有结构保持、成像深度或光损伤方面的取舍。
电子显微镜可进一步观察细胞膜、细胞器和基质的细节。二次谐波成像（second harmonic generation，SHG）能利用纤维状胶原的光学性质获得信号，适合观察胶原丰富的结构。这类分析补充了球体尺寸和活性指标，并帮助研究者结合基质分布解释药物反应。
大颗粒流式保留完整球状体的分布信息
传统流式通常先将球状体解离成细胞；大颗粒流式则直接测量完整球状体的大小、光密度及沿球体的荧光分布。综述以肿瘤细胞、肺成纤维细胞和内皮细胞共培养的既有研究为例，说明这些信号如何观察球体增长、紧密程度和细胞位置变化。该示例来自被引研究。
细胞群分布随时间改变，可以帮助解释模型中的基质重塑及细胞相互作用。迁移观察与终点活性检测因而回答不同问题：前者关注谁移动到哪里，后者关注处理结束时总体或特定细胞群的反应。
细胞组成的测量还需要考虑标记本身。膜染料可能在细胞间转移，紧密球状体中的染色也可能不均匀；不同荧光标记及具有荧光的药物，还可能出现光谱重叠。对于增殖分析，原文讨论了荧光寿命检测等方式，将细胞周期信息与单纯强度信号区分。
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药物渗透与治疗效应分别测量
阿霉素等具有自身荧光的药物，可在完整球状体中观察分布；其他药物或递送颗粒可采用相应荧光标记。共聚焦深度图像能够比较外围和内部的信号，双光子成像有助于观察更深处。药物或颗粒的性质、球体紧密程度和基质共同影响这些分布。
解离后流式提供单细胞摄取信息，但原空间位置被打散。综述还讨论了用分层标记推断相对渗透的方式，将细胞摄取与完整模型的成像结合。对递送系统而言，空间积累、进入哪些细胞以及随时间的变化，都能成为比较维度。
药效部分可以连续观察生长抑制，再配合活性、凋亡或细胞损伤指标。紧密的三维模型可能限制检测试剂进入，或影响细胞裂解和信号均一性；适用于单层细胞的检测因此需要按三维模型重新检查。综述列出三维培养专用活性试剂，以及乳酸脱氢酶释放、caspase 活化和线粒体膜电位等互补指标。
作者还列出氧消耗、胞外酸化和光谱分析等检测，用于补充模型代谢状态或分子组成的信息。对于一次药物比较，所选择的平台及指标应与研究问题对应：渗透观察、细胞群分析和总体活性共同提供更完整的三维模型反应。