206 个靶向基因用于分析细胞状态
2021 年 4 月 20 日，Cell Reports 发表洛桑联邦理工学院（École Polytechnique Fédérale de Lausanne，EPFL）与诺丁汉大学（University of Nottingham）团队的研究。作者开发 TORNADO-seq（targeted organoid sequencing）方法，通过靶向 RNA 测序分析药物处理后的复杂细胞表型。
平台选择 206 个基因，涵盖 8 类肠道细胞的标志、主要信号通路和细胞生理特征。研究者通过这些表达特征，估算类器官中不同细胞类型及分化状态的相对变化，并分析增殖、代谢、应激和细胞死亡等反应。
作者先把选定基因用于既有单细胞资料分析，所得细胞身份分类与全转录组分类约有 90% 重合，再用不同细胞群验证标志表达。该基因面板围绕肠道体系建立。
表达测量与其他检测相互核对
未处理生物学重复的原始计数相关系数超过 0.95。选取 30 个基因，将测序得到的表达变化与定量 PCR 比较，相关系数为 0.79。药物筛选的重复比较中，原始计数相关系数为 0.93，重点候选的相对表达变化相关系数为 0.65。
研究还使用免疫染色、流式细胞分析及组织染色，核对干细胞、吸收型肠上皮细胞和分泌细胞的变化。靶向表达面板与这些检测共同用于解释细胞组成及药物作用。作者按本研究条件估算，包含培养、建库和测序的成本约为每份样本 5 美元。
正常肠道类器官的分化与细胞毒性反应
野生型小鼠肠道类器官首先接受 320 种 FDA 已批准药物的筛选。按表达变化筛出 56 个初步候选，再依据干细胞或分化相关特征，识别出 27 种促进分化表型的药物。
作者认为，细胞毒性药物可快速减少增殖中的干细胞和祖细胞，使成熟的吸收型肠上皮细胞相对富集；部分非细胞毒性药物则增加其他分化细胞的比例，变化出现得较慢。研究结合基因表达、显微观察和细胞死亡检测，分析这两类反应。
不同药物呈现的分化方向也不同。他汀类药物伴随肠内分泌及 Paneth 细胞特征增加、干细胞比例下降；柔红霉素则使吸收型肠上皮细胞相对增加。部分药物降低特定细胞的标志，显示整体生长变化之外还有细胞组成差别。
肿瘤类器官的药物反应与正常模型比较
小鼠肠肿瘤来源的 AKP 类器官带有 APC、KRAS 和 TP53 相关改变，未处理时增殖特征较强、分化标志较弱。正常模型中促进分化的 27 种候选里，有 16 种也改变了肿瘤模型的干细胞及分化特征。
肿瘤模型中的药物反应可分为不同表达模式。他汀类较明显地降低增殖、干细胞、Wnt 及脂质合成特征；部分抗真菌药物增加杯状细胞和 Paneth 细胞标志；微管抑制剂则降低炎症反应相关表达。正常模型中的糖皮质激素类候选未对肿瘤类器官产生同样作用。
部分响应还具有时间差异：应激相关表达在第 1 天短暂升高，Wnt 下降与分化标志增加则在第 0 天至第 2 天逐渐出现。作者结合这些时程与基因相关网络，分析正常和肿瘤体系共享及不同的药物反应。
胆固醇相关机制线索接受补充实验检验
一些不同用途的药物在表达分析中聚为相近类别。研究者据此考察胆固醇合成或运输能否解释部分作用，并通过补充胆固醇的实验检验这一线索。多类药物诱导的分化表型得到缓解，不同药物类别的缓解程度有所差别。
部分候选对肿瘤类器官的作用强于正常类器官。作者将这一体外差异作为后续评价组织选择性的依据，同时用表达、形态和细胞活力等结果分析候选物的潜在作用途径。
人结直肠癌细胞系中的候选验证
研究选取代表不同共识分子亚型的 4 种人结直肠癌细胞系，评价 17 种候选药物，其中 10 种在人源细胞系中仍显示活性。他汀类中的阿托伐他汀和洛伐他汀作用较强；在所用含血清的培养环境中，吩噻嗪类未表现出相同活性。
作者把他汀类及其他部分候选列为后续体内验证的对象。本研究将靶向表达筛选、小鼠类器官比较和人源细胞系评价相连，临床应用仍需进一步研究。