剪接异常提供另一类候选靶点
肿瘤的新抗原不只来自基因突变，异常剪接也可能产生不同于正常组织的蛋白片段。辛辛那提儿童医院医学中心（Cincinnati Children’s Hospital Medical Center）等美国团队在 Science Translational Medicine 报道剪接新抗原发现工具（Splicing Neo Antigen Finder，SNAF），希望找到跨患者共享、可供免疫治疗研究的候选靶点。
工具包含 2 条路线。SNAF-T 寻找可能被主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）呈递并激活 T 细胞的肽；SNAF-B 寻找全长跨膜蛋白中改变的胞外部分，为抗体等识别策略提供候选。两者需要的证据并不相同。
共同起点是肿瘤核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）测序中的异常剪接连接。流程与正常组织数据库比较，再分别评估翻译、呈递或膜拓扑。肿瘤特异性由概率模型估计；SNAF-T 还结合免疫原性预测，SNAF-B 则利用长读长资料检查全长转录本。
质谱逐步核对候选身份，各阶段的验证分母不同
研究先分析 14 位卵巢癌患者的配对转录组与免疫肽组；黑色素瘤则使用 472 份肿瘤转录组，以及另外 24 位患者的免疫肽组。黑色素瘤的这 2 类资料来自不同患者，未逐一配对。
正常参照比较还需要落到具体异常连接。论文中的 FCRLA 例子显示，整基因表达的肿瘤特异性并不强，但一个特定剪接连接在 162/472 份黑色素瘤中检出，在正常血液和脾脏中仅弱表达。这说明候选筛选不能简单用整基因是否表达替代异构体判断。
为进一步核对质谱身份，团队选择 36 条候选，合成后有 27 条能被充分检测，其中 11 条与原谱匹配，7 条达到较高置信度。这些数字受到候选选择、合成肽检测和谱匹配门槛共同影响，不能转换为全部计算预测的准确率。
在共享候选分析中，团队把出现在超过 15% 黑色素瘤患者中的候选列为共享。独立免疫肽组的检索集合包含 613 条共享候选，其中 210 条有质谱支持；共享候选比仅在个别患者中出现的候选更容易被检出。
5 条候选引发健康供者 T 细胞反应
研究从 3 个异常连接中选择 5 条共享候选，按人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）类型与可用供者匹配。2 条候选在 HLA-A*02 细胞体系中显示分子稳定作用，为相应结合提供支持；其他候选的 T 细胞反应按各自匹配的 HLA 体系评估。
5 条候选均观察到 T 细胞干扰素 γ 反应，无肽或未刺激条件的反应较弱。图中每种条件为 2–3 位健康供者；研究整体至少纳入 3 位供者，不是每条候选都有相同人数。这是体外免疫活性验证，尚未展示患者接受这些候选治疗后的肿瘤缩小。
单细胞再分析还检查候选来自肿瘤还是免疫细胞。高度共享的候选主要富集于肿瘤细胞；但全部剪接新抗原中，肿瘤微环境也可能提供一部分信号。因此，组织总体表达不能自动证明候选具有肿瘤细胞特异性。
胞外候选还要经过全长结构与膜定位核对
SNAF-B 从异常连接重建可能的全长转录本，再检查蛋白是否仍具有跨膜结构及改变的胞外区域。长读长测序支持部分完整或局部预测，转录本核对后，还需测量蛋白折叠和细胞表面定位。
整合短、长读长信息后，流程得到 514 项不同的候选跨膜蛋白，再筛到 187 项新连接位于胞外、且未包含在其他已知蛋白异构体中的预测。候选数量逐步减少，但这一筛选本身仍属于计算证据。
研究进一步评估 7 项候选蛋白，其中 4 项可观察到部分膜定位。这为后续抗体或细胞治疗靶点筛选提供了候选，尚不能证明它们都有可被药物识别的稳定胞外构象，更没有完成相应抗体的抗肿瘤功能验证。
免疫治疗关联和正常组织特异性仍需谨慎解释
研究也探索新抗原负荷与生存的关系。在未接受免疫治疗的黑色素瘤队列，高负荷与较差生存相关；39 例免疫检查点治疗队列中方向相反，但总体负荷对应的生存趋势 P=0.18，未达显著。按负荷选择治疗能否改善获益，还需专门研究验证。
目前 T 细胞路线主要关注 HLA-I 呈递和 CD8 T 细胞。作者也指出，HLA-II、CD4 T 细胞及其他免疫细胞可能参与抗肿瘤反应，尚未被这套预测充分覆盖。现有阳性实验因此不能代表完整的人体免疫反应。
作者强调，正常组织参照仍不完整，罕见细胞和胎儿发育中的异构体可能被漏掉。质谱也存在假阳性和假阴性，需正交方法核对。后续应同时验证被预测为免疫活性强和弱的候选，以检验筛选门槛是否能区分不同活性的候选。