
把神经节细胞丢失当作培养质量问题
视网膜类器官能形成多种视网膜细胞,但内层神经节细胞常在后期减少。这使研究内层视网膜病变,以及评价作用于这类细胞的干预更加困难。美国迈阿密大学(University of Miami)团队在 Lab on a Chip 报告,尝试同时控制灌流和氧环境,以延长模型中神经节细胞标志的保留。
芯片采用亚克力、玻璃和气体可透膜,避免使用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)。作者关注 PDMS 较高的气体通透性及其对小分子药物的吸收,希望使氧环境更易控制;本文没有直接测量候选药物在该材料体系中的损失。
单条流路连接 55 个类器官孔位,凹形孔和捕获结构使类器官在长期培养中留在原位,并能取出分析。下方另有氧清除通道,通过膜两侧传输形成垂直梯度。55 个孔位共用流路,用于同时培养多个类器官。
先验证氧传输,再进行三组培养比较
团队先用有限元模型计算氧传输,再在台面环境用传感器核对。验证覆盖 2 个芯片、合计 8 个孔位,以 50 μm 的间隔测量不同高度。模型与台面测量大体一致,由此推算培养箱条件下孔内约 3%–18% 的氧范围。
传感器尖端难以精确贴近膜面,低位测量的起点和误差较大。作者将台面实测结果与相同环境下的模型比较,再用已核对的模型推算培养箱内的氧范围。
同一人牙髓来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)系形成视网膜类器官后,进入 3 种条件:普通培养皿、无氧梯度灌流芯片,以及有氧梯度灌流芯片。实验使用同一细胞系的不同传代,共重复 2 次。
染色面积比显示第 14 周仍保留神经节细胞标志
研究用 RBPMS 标记视网膜神经节细胞,并计算切片中 RBPMS 阳性区域与 DAPI 核染色区域的像素面积比,再归一至第 6 周。这一图像面积比用于比较不同大小类器官中的标志保留;细胞计数及神经节细胞的信号传递功能另需相应检测。
第 10 周,连续灌流相对培养皿有助于保留 RBPMS 相关信号;第 14 周,氧梯度芯片组仍有较高的面积比。不过,该组间比较的 P 值在主文为 0.045、图注为 0.454,二者不一致,统计显著性尚不能确定。作者还指出,氧梯度组变异较大,可能与取出后切片方向不确定有关。
作者希望在同一模型中保留内层与外层视网膜细胞,并提出继续检测光感受器等其他细胞类型,以判断氧梯度对整体细胞组成的影响。当前比较主要反映神经节细胞标志的保留。
共享流路中的药物递送仍需另外验证
芯片使用约 50 μL/小时培养液流量,整个系统体积约 530 μL,每日更新约 2.2 倍体积。该设计能维持长期培养,但串联孔位中旁分泌信号和化合物递送的影响,作者尚未研究。
作者提出,调整孔位和流路后可扩展到药物测试及疾病模型。其当前贡献是改进视网膜模型的氧环境与细胞保留;若用于比较药物,仍需明确各孔实际暴露、培养方向和相应功能终点。