用人源视网膜类器官比较候选光遗传学蛋白
光遗传学把感光蛋白引入细胞，使细胞对光刺激产生电反应。法国牵头团队在 Frontiers in Neuroscience 报道一项研究，利用人源视网膜类器官比较不同候选蛋白在感光细胞中的表达与功能。
团队从 1 株人皮肤成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）建立视网膜类器官。培养第 28 天分离神经视网膜组织，第 44 天加入腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）的 AAV2-7m8 载体，每个类器官的载体剂量为 5×10¹⁰个病毒基因组。
第 70 天的类器官外层已包含感光细胞前体，但缺少完整外节，视网膜神经节细胞较少。这个发育阶段用于观察外源感光蛋白在细胞膜上的分布和光响应。
比较包括 eNpHR3.0、Jaws、hCatCh、ChrimsonR 和 ReaChR，共 5 种微生物视蛋白。各蛋白与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）连接表达，并以仅表达 GFP 的条件提供参照。
膜定位能力随候选蛋白不同而改变
显微成像显示，eNpHR3.0、Jaws 和 ReaChR 在细胞膜上分布较明显。hCatCh 和 ChrimsonR 则更多出现在细胞内部，提示候选蛋白进入膜表面的效率不同。
团队进一步用内质网和高尔基体标志检查细胞内滞留。hCatCh 与这些区域出现部分重叠，ChrimsonR 没有显示同样稳定的滞留模式。
成像因此补充了单纯荧光强度的比较：细胞产生了外源蛋白后，还需要观察蛋白在何处，才能解释后续光刺激电流的变化。
膜片钳直接测量光诱导电流
研究者先用双光子成像寻找表达 GFP 的细胞，再用膜片钳记录。细胞保持在−60 mV，分别接受 450 nm 蓝光或 590 nm 橙光，以及 2 档光强刺激。
5 种微生物视蛋白均产生光诱导电流，仅表达 GFP 的对照没有相同反应。不同蛋白的电流方向与动力学有差异：部分候选产生去极化作用，另一些产生超极化作用。
两档光子通量为 1×10¹⁶和 3.2×10¹⁷ photons·cm⁻²·s⁻¹。研究同时比较电流幅度，以及光刺激开始和结束时的电流变化，以描述候选蛋白在同一人源组织背景中的功能。
膜片钳与定位成像提供不同层面的信息。细胞内分布较多的候选也能产生光诱导电流，但其蛋白定位与其他候选存在差异。
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hCatCh 伴随应激标志增加
团队检测未折叠蛋白反应相关指标，以判断外源蛋白表达是否伴随细胞应激。hCatCh 条件的内质网应激标志免疫球蛋白结合蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）的阳性细胞比例高于 GFP 对照；ChrimsonR 没有相同的显著增加。
研究还比较部分应激相关基因的 RNA 表达，并观察细胞形态。在所测条件下，作者没有观察到明显细胞死亡。
应激检测有各自的重复层级：RNA 分析为 4 个生物重复，BiP 阳性比例的图示比较为 3 个重复。细胞定位、光诱导电流和应激指标共同用于评价候选。
发育阶段与单一细胞背景限定比较范围
这项研究在同一人源类器官背景中结合蛋白定位、膜片钳和应激检测，具体比较 5 种光遗传学候选。其模型来自 1 株 iPSC，功能实验集中在尚未形成完整感光细胞外节的阶段。
作者提出，后续可在更成熟的视网膜组织中继续考察蛋白向细胞膜的运输和应激。培养阶段、外源表达方式以及候选蛋白的细胞内分布，都是延伸这类比较时需要控制的因素。