两类视网膜模型追踪同一种遗传病
PRPF31 参与 RNA 剪接，部分变异可引起常染色体显性视网膜色素变性。同一种变异携带者的发病情况可能不同，也使研究者关注正常 PRPF31 表达水平与细胞功能的关系。法国视觉研究所（Institut de la Vision）等团队在 npj Regenerative Medicine 报道，用患者细胞分别建立视网膜色素上皮和类器官，测试补充正常基因能否改善疾病表型。
团队从 2 位患者和 1 位未患病家属的皮肤细胞建立诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）。2 位患者分别携带 Cys247X 和 Tyr90CysfsX21 变异；另引入 1 位携带 Cys247X 但未发病者的既有细胞系，并通过 CRISPR/Cas9 修复其中 1 位患者的变异，形成相同遗传背景的参照。
这些细胞一部分分化为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）单层，另一部分形成视网膜类器官。两种体系分别检测屏障与吞噬功能，以及视杆、视锥细胞的成熟和后续退化。
色素上皮的形态、屏障与吞噬功能受损
未患病家属和基因修复后的 RPE 形成规则的色素细胞单层，患者 RPE 的细胞接触、形状和极性则出现异常。ZO-1 紧密连接染色分布不规则，正常位于不同细胞表面的 Ezrin 和 BEST1 蛋白也发生定位变化。
在最长 13 周的培养中，患者 RPE 没有形成显著的跨上皮电阻。团队加入荧光标记的猪感光细胞外节片段，培养 3 小时后区分附着与已吞入信号；患者细胞的内吞信号约为参照的一半。PRPF31 蛋白表达也明显降低。
未发病变异携带者的 RPE，以及在患者 iPSC 中插入一份正常 PRPF31 后形成的 RPE，形态和吞噬功能均改善，跨上皮电阻升高。这里采用的是先改造 iPSC、再分化细胞的实验路径。
类器官中先出现视杆减少，随后视锥减少
早期培养时，患者类器官能够形成视杆和视锥细胞，第 100 天的视杆标志 NRL 与第 130 天的视锥标志 hCAR 未显示明显差别。第 130 天以后，患者类器官中的 NRL 阳性细胞逐渐减少，第 175 天时占比降至 10% 以下。
视锥细胞减少出现得较晚，在第 175 和 200 天更为明显。感光细胞所在的外层细胞密度下降，并出现活化 caspase-3 凋亡染色；双极细胞和 Müller 胶质细胞的标志染色没有同样改变。
基因修复、正常 PRPF31 拷贝插入和未发病携带者的模型，均保留了较多感光细胞。这些比较将 PRPF31 蛋白水平、具体变异与退化过程联系起来。
退化前加入 AAV，保留更多感光细胞
在 iPSC 改造实验之后，团队进一步测试直接向类器官递送正常 PRPF31。载体采用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）2-7m8 衣壳和 CAG 启动子，在第 85 天加入，每个类器官一次接受 4×10⁹ 个载体基因组；该时点早于感光细胞明显退化。
第 175 天检测时，处理类器官约有 40% 的 NRL 阳性视杆细胞和 20% 的 hCAR 阳性视锥细胞，与未患病参照的范围相近。染色定量以切片区域内 DAPI 标记细胞为分母，来自至少 3 个独立分化批次、每种条件至少 9 个类器官。
PRPF31 蛋白在 AAV 处理后升高，视紫红质等感光细胞标志也恢复。实验由此分别检验了基因修复、iPSC 中增加正常拷贝，以及类器官阶段病毒递送的效果。
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下一步关注干预时点与表达剂量
作者将正常 PRPF31 表达不足作为这两种变异的重要疾病机制，并提出 AAV 基因补充的后续方向：在退化已经开始后测试干预，确定有效时间窗，并评价较高表达量对 RNA 剪接和细胞稳态的影响。
研究的类器官缺少贴附的 RPE 单层和血管供养，体外退化发生得较早。作者因此把模型中的培养应激与患者病程差别纳入讨论，同时保留 RPE 和感光细胞两个体系各自的评价结果。