用细胞对追踪连接形成的先后过程
致心律失常性心肌病（arrhythmogenic cardiomyopathy，ACM）可涉及心肌细胞之间的连接异常。美国哈佛大学（Harvard University）与波士顿儿童医院（Boston Children’s Hospital）等机构的团队，使用人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）衍生心肌细胞，构建细胞对和工程化组织，研究 PKP2 变异如何影响连接组装，并比较药物处理后的变化。
细胞对由 2 个心肌细胞首尾相接。团队在软基底上设置长方形细胞外基质区域，使细胞具有相近形状，便于对齐成像和比较蛋白分布。纤连蛋白与 GelTrex 混合基质比单用纤连蛋白提高了细胞黏附的一致性；优化后，印刷区域的细胞覆盖率为 64%。
野生型细胞对中的 N-cadherin、plakoglobin 和 PKP2 在第 6 天主要定位到细胞连接处，缝隙连接蛋白 CX43 到第 9 天才出现稳定的连接处定位。研究把多个细胞对的染色结果叠加为热图，再量化蛋白分布中心和宽度，以比较连接形成的过程。
PKP2 变异同时影响细胞骨架和连接
团队还以方向有序度参数量化肌动蛋白和肌节的排列，检查它们是否沿心肌长轴或短轴形成相应结构。与未限定形状的培养相比，细胞对的排列更一致，便于在多个分化批次间比较相同阶段的结构质量。
疾病模型携带杂合 PKP2 R413X 截短变异，与同基因背景野生型比较。研究建立 C93 和 C98 两个克隆，以 C98 完成主要实验，再用 C93 检查部分关键结果。两种基因型的心肌分化效率相近，使团队能够将重点放在分化后细胞的结构差异。
突变细胞对的 N-cadherin 定位推迟到第 9 天，plakoglobin、PKP2 和 CX43 的连接处定位也受到影响。部分蛋白仍弥散在胞质或聚集于细胞核周围，显示连接组装未按野生型的时间顺序完成。
骨架分析中，突变细胞对早期的肌动蛋白排列较差，随后肌节 Z 盘的形成减少。野生型中结构和连接逐渐形成的过程，在突变模型中出现延迟或受损。团队据此把细胞形状、骨架排列与连接蛋白定位共同用于描述疾病表型。
SB216763 改善部分指标，野生型反应不同
研究采用 GSK-3 抑制剂 SB216763，增强 Wnt/β-catenin 信号，观察能否改善突变细胞对。药物增加了突变细胞对的肌节 Z 盘形成，并在第 9 天使 plakoglobin 和 CX43 的连接处定位接近野生型对照。
改善并不覆盖所有连接蛋白。N-cadherin 定位未显著受药物影响，PKP2 定位也没有恢复；第 6 天的 plakoglobin 异常仍存在。药物未提高突变细胞的 PKP2 转录或蛋白水平，作者认为作用主要涉及其下游过程。
野生型细胞对却出现相反变化：SB216763 降低肌动蛋白排列，并使 N-cadherin、plakoglobin 和 CX43 的连接处定位受损。相同处理对突变与野生型的结构影响不同，这一结果也是论文讨论长期药物作用时保留的重要问题。
团队另在单层培养物中检测蛋白的胞质、细胞核和膜分布。药物提高突变细胞中的核内 β-catenin，但单层中 plakoglobin 和 CX43 的分级检测没有显示与细胞对染色完全相同的改善。作者将这一差异与两种培养形式的连接组装条件联系起来。
工程组织中的钙波传播在第 9 天改善
为了检查组织层面的功能，团队用微结构引导心肌细胞定向排列，设置较窄的组织颈部，并通过荧光成像记录刺激后的钙波传播。两个观察时间中突变组织的钙波传播均较慢。第 9 天，野生型平均速度为 21.4±5.6 cm/s，突变组织为 10.7±3.3 cm/s。
SB216763 在第 9 天将突变组织的钙波速度提高到 18.1±4.8 cm/s，接近野生型；第 6 天没有观察到同样改善。野生型组织的钙波速度未显著受药物影响，工程组织中也未见细胞对中同样的结构不良变化。药物作用因此还与观察时间和组织形式有关。
这项研究在同一人源疾病背景中，把连接蛋白位置、细胞骨架和组织钙波联系起来，便于评价药物对结构与功能的不同影响。目前结果集中在 PKP2 R413X 变异，作者提出继续研究其他 PKP2 变异和 ACM 相关基因，并进一步检查这类干预的作用机制与潜在不良影响。
窄屏可横向滑动查看完整图表。