整体荧光相近，内部积累仍可能不同
三维细胞球状体中的物质分布并不均匀。只测整个球的荧光，容易丢失外围与中心的差别。布朗大学（Brown University）研究团队在 Molecular Pharmaceutics 提出分层分析，把二维荧光图像结合球状体几何形状，估计不同深度区域的积累。
研究使用多种人源肿瘤细胞及 HEK 细胞，形成球状体后加入钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein-AM）。该分子进入细胞，经酯酶转化为荧光钙黄绿素。前者的细胞摄取与外排、后者的细胞间转移，共同影响所见荧光分布。
先检查成像条件，再计算各层信号
团队先检查球状体高度对荧光定量的影响。在这套宽场成像条件中，高度约 205 μm 以内，荧光与成像路径长度保持可用的线性关系；高度更大时，中心信号容易被低估。后续分层计算据此限定模型大小。
分析把球状体划为外围、中间及中心区域，并通过几何换算得到各层荧光浓度。除总量之外，还比较中心所占比例和从外向内的浓度梯度。不同细胞形成的球状体呈现不同分布，其中 OVCAR-3 的中心积累较低。
不同抑制剂改变总体积累与中心分布
P-糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）能够排出 calcein-AM。高表达 Pgp 的 HEK-MDR 球状体积累较低，加入维拉帕米后增加，说明模型能够检测抑制外排所带来的摄取变化。
在 KGN 球状体中，维拉帕米与洛哌丁胺均提高整体钙黄绿素荧光，但信号更多集中在外围，中心所占比例反而降低。环孢素 A 也提高总体积累，却没有产生同样明显的梯度变化。总量与中心分布因抑制剂而不同。
研究据此考察缝隙连接介导的细胞间沟通（gap junctional intercellular communication，GJIC）。这种细胞连接可让小分子在相邻细胞之间转移；抑制外排和抑制这种转移，可能同时改变球状体的荧光。
缝隙连接抑制剂使荧光留在外围
加入 100 μM 卡苯氧酮后，中心钙黄绿素约占总量的 0.5%，未处理参照约为 15%；对应比较包含 18 个球状体。与此同时，整体钙黄绿素约为参照的 2.3 倍，但分层计算显示中心区域的分配明显减少。
撤去染料后，两组荧光下降的初始速度相近，半衰期约为 5.3 小时和 5.9 小时。作者据此认为，处理后的总体积累增加主要与摄取和外排相关，而中心积累减少与细胞间扩散受抑制相符。
用空间分布补充单一总体指标
这个方法把总体积累、外围浓度和中心比例分开测量，可用于筛查具有多种转运作用的化合物。本文的定量对象是荧光探针，其他药物的球状体分布仍需使用相应分析技术测量。
作者还指出，其他外排转运体可能参与钙黄绿素分布。模型对缝隙连接和 Pgp 的判断来自抑制剂比较，后续可结合分子层面的证据进一步区分具体作用。