
小鼠细胞与流动隔室构成屏障模型
美国犹他大学(University of Utah)的 Ross Booth 与 Hanseup Kim 在 2012 年的 Lab on a Chip 报道微流控血脑屏障模型。装置在 2 个流动隔室之间设置 10 µm 厚的多孔聚碳酸酯膜,在两侧培养 b.End3 脑内皮细胞与 C8-D1A 星形胶质细胞,并用内置电极连续观察屏障电阻。论文首次发表于 2012 年 3 月 1 日。
2 种细胞均为小鼠来源。b.End3 来自脑血管内皮瘤,C8-D1A 来自小脑星形胶质细胞。研究比较的是非人源细胞系构成的屏障。
作者同时设置内皮单培养与内皮—星形胶质细胞共培养,并以静态 Transwell 中的相应培养物参照。评价包括细胞形态和存活、紧密连接标志、跨内皮电阻(trans-endothelial electrical resistance,TEER)及示踪物通透,分别观察结构、完整性和运输性质。
内皮培养第 3 天的存活比例超过 90%,紧密连接蛋白 1(zonula occludens-1,ZO-1)比第 2 天表达更清楚;星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。膜孔约 0.4 µm,细胞突起通常更宽,作者认为突起穿孔形成直接末足接触的可能性较小。
电阻比较与组胺后的动态恢复提供不同信息
芯片和静态体系通常都在内皮培养第 3–4 天达到相对稳定的电阻。两种体系中,共培养均高于内皮单培养;芯片共培养 TEER 通常超过 250 Ω·cm²,静态共培养约 25 Ω·cm²。图 6 标注各组 n>3,但没有将这一数量定义为患者或独立供者。
计算 TEER 时,研究扣除培养开始时的背景电阻,再按面积校正。芯片采用固定电极,静态对照则放入测量腔;两者虽然使用相同细胞、培养液配方和电阻仪,电极大小、间距和方向仍有差别。
作者提出流动剪切力可能促进屏障,同时列出其他影响比较的条件。细胞总数、液体体积、培养表面积与体积之比、内皮与星形胶质细胞比例也不同。这些因素共同限制了对约 10 倍电阻差异的因果解释。
共培养芯片受组胺扰动后,电阻迅速降低,随后恢复。较低与较高暴露档分别出现约 30% 和 50% 的最大下降;正文描述恢复约需 6 分钟和 15 分钟,图 8 分别展示 3 个样本。连续测量因而能够记录单一终点不易呈现的扰动时程。
示踪物按大小通透,极端 pH 下屏障减弱
通透比较在电阻稳定后进行,使用 4、20 和 70 kDa 荧光标记葡聚糖及碘化丙啶。研究根据接收侧荧光标准曲线换算浓度,并扣除空白膜的影响。流动持续提供源侧溶液,使通透计算所采用的源侧浓度条件较容易保持。
较小示踪物更容易通过屏障;内皮—星形胶质细胞共培养的通透低于内皮单培养,与较高电阻方向一致。培养液 pH 升至 10 以上并维持 4 小时后,各类示踪物的通透增加,显示极端条件下屏障功能减弱。图 9 标注 n>3。
尽管芯片表现出大小选择性,单培养及共培养的通透仍高于文中引用的体内资料。这一研究主要完成鼠细胞屏障的结构与功能比较,没有系统测试治疗药物,也没有建立人体脑暴露预测准确率。
作者将该装置定位于屏障功能与药物递送研究:可连续观察屏障增强或开放时的电阻变化,并比较跨屏障运输。后续具体候选药物的评价仍需相应底物、转运性质与体内资料;本研究的示踪物结果为这种用途提供了模型质量依据。