微孔装置结合 9 档浓度与重复刺激，追踪单细胞响应
细胞对药物的反应既受浓度影响，也可能随刺激时间和节律改变。墨西哥研究团队在 Analytical Chemistry 报道一种微流控装置，以卡巴胆碱刺激人胚肾细胞系（human embryonic kidney 293，HEK293），逐个观察钙信号的变化。
装置将 9 档线性浓度送入 9 个腔室，每腔有 492 个用于捕获细胞的微孔；阀门控制刺激液与缓冲液交替流过。装置用来持续测量微孔内单个细胞的钙信号。
将细胞限制在微孔内，是为了在流动条件下持续追踪同一细胞，避免细胞随液体离开视野。浓度和频率可以组合比较，但实际药理实验只测量了 9 个腔室中的 5 个，设计容量与实际检测量有所不同。
研究关注同一刺激到来后，哪些细胞先响应、哪些始终不响应，以及反应能否随多次刺激维持。连续观测与单细胞分析可以分别呈现这些差异。
示踪性能与细胞染色，先回答装置是否稳定
团队用 2 种分子量不同的荧光示踪物检查梯度，再以重复脉冲检验切换。测试的最高频率约为 33.3 毫赫兹，对应周期约 30 秒；下游微孔完成换液约需 15 秒，决定了较快信号能否被清楚呈现。
上游微孔约 7 秒即可完成换液，下游约为 15 秒。用最慢区域确定工作节律，是为了让各处细胞接受的脉冲有相对可比的完整过程；若只按较快区域设定频率，暴露形状可能随位置改变。
多次脉冲总体达到预期浓度，但部分腔室出现小于 10% 的峰值超调。作者认为它未必显著影响所示细胞检测，不过这仍是装置误差；卡巴胆碱在各腔中的实际浓度尚未独立进行化学测定。
另一项表征使用钙黄绿素前体染色，观察细胞内酯酶相关荧光。研究追踪 1,560 个细胞，累计 750,720 个时间点数据；这些是细胞和重复观测数，并不是同样数量的独立实验。
2 种示踪物分别为小分子荧光素衍生物与约 40 千道尔顿的葡聚糖衍生物，分子量相差明显，仍能形成相反方向的线性梯度。这个比较检查了混合模块对不同扩散速度物质的适用性。
有染料的细胞荧光随时间增加，终点总体随浓度升高；无染料条件没有这种增加。单细胞分布同时显示，即使群体均值相近，个体响应仍存在差异。
卡巴胆碱浓度升高，改变响应比例和起始时点
正式药理示范使用卡巴胆碱（carbachol），比较 0–10 μM 范围内的细胞钙信号。2 组细胞分别接受约 4.5 毫赫兹的 5 次脉冲，或 20 毫赫兹的 10 次脉冲，2 组使用不同装置和细胞，分别进行实验。
卡巴胆碱可激活这类细胞内源表达的 M1 型毒蕈碱受体，通过细胞内信号促进钙库释放。研究用钙敏感荧光指示剂记录这一变化，因此所见读数首先反映钙信号，而不直接代表细胞存活或器官功能。
在较低频率下，1.25 μM 约有 15% 细胞响应，通常到第 4 次刺激后才出现；3.75 μM 时约为 25%，多数从第 2 次开始。到较高浓度，细胞从第 1 次刺激便可响应，并随刺激节律变化。
响应细胞比例在 6.26 μM 约为 30%，10 μM 约为 50%。这说明平均荧光升高可能同时来自响应细胞增多及单个细胞信号改变，二者需要分别分析。
研究同时画出全部细胞与仅响应细胞的平均曲线。后者反映有反应细胞的信号，前者还包含未响应细胞；把 2 种曲线混用，会改变对药物作用强弱的判断。
更快刺激并未带来一致增强，无药流动也会产生信号
20 毫赫兹时，部分细胞在最低测试浓度便从第 1 次刺激开始响应；较高浓度的首个钙信号更大，但后续脉冲响应逐渐衰减。响应比例随浓度变化较小，到 10 μM 也只约为 30%。
频率变化对响应起点、幅度、衰减及响应细胞比例的影响各不相同。2 组的脉冲数和细胞也有差别，需按具体指标解释比较结果。
高频条件下，无药缓冲液也使少数细胞出现钙信号。作者将其与流速骤变造成的膜变形、机械敏感通道激活联系起来。这个伪影说明，动态药理实验需要与刺激节律匹配的流体对照。
实际贡献是信号检测，仍有速度和模型范围限制
论文约分析了 2,200 个细胞的钙响应，展示浓度与节律如何揭示群体内部差异。它提供的是受体刺激与单细胞读数的可行性，尚未验证疾病模型、候选药物排序或患者治疗反应。
单细胞曲线还以聚类热图呈现，一行对应一个细胞随时间的信号。聚类用于把相似轨迹排在一起，便于观察异质性。
换液速度限制了对快于约 15 秒过程的研究。缩小腔室可能提高速度，却会减少可同时观察的细胞；其他信号或细胞类型的应用，也仍需满足荧光读数等条件并另行验证。