用人多能干细胞比较肺泡分化条件
支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早产儿慢性肺病。开发针对这一疾病的药物，需要能反映人肺泡发育与损伤的体外模型。加拿大病童医院（The Hospital for Sick Children）等团队比较肺类器官的细胞组成和机械环境，研究哪些条件有助于形成肺泡二型上皮细胞（alveolar epithelial type 2 cell，AEC2）。
团队使用 CA1 人胚胎干细胞和 NCRM1 人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），先诱导肺祖细胞，再开展三维培养。主要比较围绕 CA1 模型；SFTPC-GFP 报告细胞与 HT2-280 表面标志用于交叉检查 AEC2 身份。
延长肺祖细胞诱导后，NKX2-1 阳性比例从第 15 天的 21.79±4.21% 升至第 22 天的 44.35±3.32%，分别来自 14 和 25 次独立分化。后续类器官培养只选用阳性比例超过 50% 的批次。DAPT 抑制 NOTCH 信号没有进一步提高祖细胞诱导效率。
较高接种密度产生更多、更小的类器官
三维培养比较 25,000 与 100,000 个肺祖细胞的起始接种量。接种量增加 4 倍后，类器官数量更多，单个尺寸更小：第 36 天平均直径分别为 215.95±11.45 μm 和 129.12±5.66 μm。形态测量中，每个生物重复、每种条件检查超过 150 个类器官。
第 43 天，高密度组的 HT2-280 阳性细胞比例为 20.15±6.05%，低密度组为 7.20±1.20%。相关肺泡标志基因表达也较高。不过，高密度组的 CDH1 阳性上皮细胞比例反而较低，高密度组仍包含其他细胞群，肺泡标志比例和整体上皮比例需分别评价。
继续培养到第 50 天未进一步增加 SFTPC-GFP 阳性比例。超微结构中可见含成熟表面活性蛋白 B 的前板层多泡结构，却未见成熟板层小体；这些结果提示 AEC2 仍偏未成熟。模型也未检出肺泡一型细胞的 PDPN、AQP5 标志。
提高祖细胞纯度没有增加最终肺泡二型细胞
团队在第 22 天依据表面羧肽酶 M（carboxypeptidase M，CPM）分选肺祖细胞。分选后，NKX2-1 阳性比例由 44.35±3.32% 提高到 80.54±4.05%；但到第 43 天，由分选细胞形成的类器官，其 HT2-280 阳性比例低于未分选组，CDH1 阳性比例没有明显改变。
这项比较采用 NKX2-1 阳性比例超过 50% 的未分选批次作参照。图 3 的主要分选与终点比较各有 4 个生物重复。其他研究曾采用 NKX2-1 阴性细胞作参照，各结论适用于各自比较对象。
分选类器官的波形蛋白 VIM 和 ACTA2 间充质相关信号较少。作者据此提出，分选可能同时移走了协助肺泡分化的间充质细胞；这些结果支持细胞组成参与分化，但尚未确定所有被移除细胞的身份及具体支持机制。
成纤维细胞支持不依赖直接接触
研究另用 Transwell 共培养检查这一解释：肺祖细胞位于插入层，下方培养人胚胎肺成纤维细胞。成纤维细胞预先限制增殖，以减少过度生长。Matrigel、层粘连蛋白或 IV 型胶原三种基底条件下，共培养均增加 HT2-280 阳性细胞比例，CDH1 阳性比例则相近。
将两种细胞直接放在一起，没有比隔层共培养进一步提高肺泡二型细胞比例。图 5 的隔层实验为 4 个生物重复，直接接触比较至少 10 个。结果提示，可溶性支持信号已经能够发挥作用；具体由哪些分泌因子组合产生最佳效果，仍未确定。
周期拉伸增加肺泡标志，模型成熟度仍有限
团队在三维基质中施加 5% 伸长、1 Hz 的周期拉伸，以每小时拉伸 15 分钟、停止 45 分钟的方式模拟胎儿呼吸运动。与同样使用 80% Matrigel 的静态配对培养相比，拉伸组的 HT2-280 阳性比例和 SFTPC 表达增加；Ki-67 增殖指标、CDH1 上皮比例及近端气道相关基因没有显著变化。
原子力显微镜测得，接种前的 50% 和 80% Matrigel 在室温下弹性模量相近。这个比较排查了初始基质刚度差异，却不能排除培养中基质改变的影响，也不说明模型已经具有成人肺泡的力学性质。
本次主要终点是分化标志与细胞比例。约三分之二的 CDH1 阳性细胞不表达 HT2-280，身份尚未全面厘清；研究未做单细胞转录组分析，拉伸时机和频率也需进一步贴近发育过程。
这些条件比较为构建 BPD 研究和药物评价平台提供模型质量依据。作者提出后续结合高氧与损伤性拉伸研究，本次实验范围是分化与模型条件，BPD 损伤诱导、候选治疗和临床药物反应均留待后续评价。