混合培养先要回答：还能否分清每个供者
多供者人源细胞可以帮助研究药物反应中的个体差异，但把每条细胞系分别培养和测量，规模很快就会受到时间与成本限制。澳大利亚 Garvan Institute of Medical Research、昆士兰大学（University of Queensland）和墨尔本大学（University of Melbourne）等机构的团队，在 Nature Communications 报告了一种“细胞村”评价：将不同供者的人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）放在同一培养体系，再通过单细胞测序辨认来源。
研究重点检验混合培养会不会改变细胞系各自的表达特征。如果细胞间信号使原有差异被掩盖，扩大培养规模也可能损失研究个体差异所需的信息。团队因此同时检查细胞系占比、基因表达和遗传变异对表达的影响。
3 家实验室比较独立培养、混合培养和冻存
第一部分使用相同的 3 条细胞系，在 3 个地点比较独立培养与混合培养。各地使用同代次细胞和相同批次试剂，其中 1 个地点的接种密度较低。混合培养后进行单细胞 RNA 测序，计算分析依据遗传差异，将细胞分回各自来源的细胞系。
另一部分检查冻存及复苏是否改变细胞系差异。团队还把细胞状态纳入分析，区分多能性较高的细胞与已经开始自发分化的细胞，避免把状态变化全部归因于供者。3 个地点的比较、冻存比较和细胞状态分析分别回答不同的质控问题。
身份识别还需要排除一个液滴中混入 2 个细胞的情况。3 条细胞系的实验联合多种遗传分配与双细胞识别方法，只保留多种方法对单细胞身份达成一致的数据。质控后，最初捕获的 144,988 个液滴中有 88,927 个高质量单细胞进入分析，这些高质量单细胞用于后续表达与遗传效应分析。
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表达特征大体保留，生长速度却会改变占比
在 3 个细胞系的实验中，各样本都能识别出全部来源细胞系，但混合培养后的占比并不总与起始比例相同。2 个地点出现 FSA0006 占比增加，另外 2 条细胞系占比减少；低密度地点未观察到相同变化。后续生长测量显示，FSA0006 的生长速度接近另外 2 条的 2 倍。
表达数据则呈现另一种情况。同一细胞系在独立培养和混合培养之间的表达差异，整体小于细胞系之间的差异。在新鲜样本中，细胞系平均解释基因表达变异的 0.71%，混合培养状态解释 0.22%，两者交互项解释 0.32%。这些是跨基因平均的变异比例，部分基因仍受到培养安排影响。
常见多能性标志物也保留了细胞系之间的差异，混合培养造成的多数效应较小。冻存样本的结果支持细胞系表达特征仍可辨认，但其变异分解数值与新鲜样本不同。研究据此支持混合培养的可用性，同时把细胞组成变化作为需要单独监测的问题。
遗传表达效应和细胞状态差异仍可检测
团队进一步分析表达数量性状位点（expression quantitative trait loci，eQTL），即与基因表达水平相关的遗传变异。在可与既有结果比较的位点中，独立培养和混合培养之间有 88.6% 的等位基因效应方向一致；相关结果支持用混合体系识别细胞系特有的遗传表达效应。在本数据集中具有至少 2 种基因型的可比较位点里，新鲜独立培养与混合培养的既有 eQTL 效应方向复现比例分别为 69.7% 和 70.6%；这一比较同样支持 2 种培养安排下保留遗传表达特征。
细胞状态也会改变这种差异的大小。按照单细胞数据估计的状态变化顺序，研究发现 1,965 项显著的动态细胞系效应；例如 CHCHD2 的表达差异，在多能性较高的细胞中更大。这里的状态变化顺序由单细胞转录数据推算。
扩展到 18 条细胞系后，长期组成成为关键
较大规模的实验将 18 条 iPSC 细胞系共同用于心肌分化，并在另一项实验中观察混合体系多次传代。心肌分化的 15 天内有 5 条细胞系不再检出，主要损失出现在最初 2 天；到混合培养第 8 代时，有 10 条不再检出，多数在第 4 代时已经丢失。生长较快的细胞系通常占比更高。
即便组成发生变化，18 系实验仍保留可分析的细胞系表达差异，可测既有 eQTL 中有 83% 的效应方向得到复现。研究的结论因此包含 2 个方面：单细胞身份识别能保留群体研究所需的信息，而长期混合培养需要筛选生长速度相近的细胞系，并持续检查各来源是否仍被代表。