球状体预选、成像与单细胞分析构成检查流程
三维肿瘤模型用于药物筛选时，样本大小、形状与细胞组成会影响比较。匈牙利 HUN-REN 生物研究中心（HUN-REN Biological Research Centre）等团队建立 HCS-3DX，将高内涵筛选（high-content screening，HCS）的样本预选、成像与分析结合，检查这些差异。研究发表于 Nature Communications。
流程包含 SpheroidPicker 自动选择和转移球状体、定点成像孔板，以及光片荧光显微成像（light-sheet fluorescence microscopy，LSFM）。后续用 Biology Image Analysis Software（BIAS）分割和分类三维图像中的单细胞，提取球状体、细胞及局部邻域特征。
主要模型为 HeLa Kyoto 人宫颈癌细胞单培养，及其与 MRC-5 人成纤维细胞共培养的球状体；T-47D 人乳腺癌球状体用于成像方式比较。研究实际验证了预选、成像及细胞组成分析，药物筛选是这些方法拟支持的用途，本文没有进行治疗药物效力比较。
相同制备条件仍产生不同大小与形状的球状体
3 名有经验的操作人员各重复 3 次实验，共得到 426 个球状体，其中单培养 223 个、共培养 203 个。即使使用相同设备和条件，样本大小和形状仍有操作人员及批次差异。共培养接种的总细胞数更多，形成的球状体体积却平均更小，显示细胞组成也影响紧密程度。
团队将同一批 50 个球状体以 4 种物镜倍率成像，得到 200 张图像，以 20 倍图像的标注作为参照。大多数二维特征平均差异低于 5%，二维体积估计的差异接近 6.5%。低倍率拍摄较快，但边界标注与依赖边界的圆度等指标受到分辨率影响。
预选特征的组合也改变了可选样本数量。直径与圆度一起分析时，更多球状体被归为相似；改用面积等组合，结果会变化。作者因此建议同时采用一个大小指标和一个形状指标，并强调二维预选可去除明显异常样本，却难以确保三维结构一致。
定点孔板缩短成像准备时间，保持图像质量
成像孔板以氟化乙烯丙烯共聚物（fluorinated ethylene propylene，FEP）薄膜形成独立样本位置，配合支撑、定位和固定部件。该设计使多个球状体在同一孔板内保持预定位置，减少逐个更换和重新校准的操作。它是成像载具，本文的主要模型为球状体培养。
成像质量比较采用两组各 5 个 T-47D 球状体，分别置于孔板或琼脂糖包埋的玻璃毛细管中。按图像强度方差评价模糊程度时，两种方式没有显著差异。时间比较另采用每种方式 10 个样本：孔板总耗时为 48 ± 7 分钟，传统方式约为 102 ± 9 分钟，差异主要来自准备、更换及校准。
研究还随机选择 110 个单培养和 114 个共培养球状体进行三维分析。二维估计与三维实测的形状、体积及细胞数量关系并不完全一致；不规则样本更难由单张二维图像预测。三维成像因而补充了外形预选所不能说明的结构信息。
单培养与共培养中，三维体积和分割细胞数的相关系数分别为 0.83 与 0.90，二维面积的对应值为 0.53 与 0.62。面积相近的样本因此未必有相近细胞数。该比较把外形、体积和细胞数量分开，有助于检查模型差异究竟来自细胞增减，还是排列与紧密程度。
单细胞组成显示外形相似模型仍有内部差异
共培养模型起始采用 HeLa Kyoto 与 MRC-5 的 1:4 接种比例。对 114 个球状体完成单细胞分割和分类后，72 个以 MRC-5 为主，28 个以 HeLa Kyoto 为主，14 个两类细胞数量相等；共分析 32,012 个分割对象。起始接种比例并没有保证最终每个模型具有相同组成。
细胞分类采用多层感知机（multilayer perceptron，MLP）。团队为两类细胞各标注 750 个训练对象，10 折交叉验证的平均准确率为 98.59%。这一性能来自该标注数据内的交叉验证。
不同细胞占比的球状体在大小和总细胞数上存在差异，形状指标却未显示同样差别。仅看二维大小或圆度，可能把不同细胞组成的样本放在一起比较。对于依赖肿瘤与基质相互作用的药筛，细胞比例和空间结构因此是模型质量需要检查的内容。
主要单培养和共培养模型在 48 小时固定后检查，只代表一个时间点。作者指出，模型仍较简化，后续应增加细胞种类及细胞外基质成分，并开展动态观察。