CRX 基因补充在患者视网膜类器官中部分恢复视蛋白表达

两种显性变异用患者与家属细胞配对

CRX 编码参与感光细胞发育的转录因子，部分显性变异可导致早发视力损伤。美国国家眼科研究所（National Eye Institute，NEI）研究者在 Stem Cell Reports 报道，利用患者视网膜类器官，测试增加正常 CRX 表达能否改善与显性变异相关的细胞表型。

研究从 2 位 Leber 先天性黑矇（Leber congenital amaurosis，LCA）患儿及各自未患病父母的皮肤细胞建立诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）。2 位患者分别携带 I138fs48 移码变异和 K88N 变异；每个患者模型均与相应家族健康参照比较，类器官在 96 孔板中逐个培养。

早期分化阶段，患者与参照均能形成视网膜神经上皮，感光细胞表达 CRX 和 Recoverin。到感光细胞开始形成外节样结构时，患者模型的差别逐渐显现，因而后续评价覆盖多个培养时点。

成熟障碍集中在外节与视蛋白表达

I138fs48 模型在第 90 天可检测到截短 CRX 蛋白，总 CRX 蛋白水平较高。第 125 天起，健康参照逐渐出现视紫红质染色，患者类器官几乎没有相同信号；长／中波敏感视锥视蛋白阳性细胞也明显减少。

患者模型的外节样“刷状”结构、Peripherin2 外节相关蛋白及多种感光功能转录本受到影响，带状突触的发育则未显示同样的改变。K88N 模型同样出现外节样结构较弱、视紫红质和视锥视蛋白表达不足，但其总 CRX 水平较低。

两种变异在 CRX 总量上的变化不同，感光细胞成熟相关的部分表型相近。这为分别测试基因补充提供了共同的检测对象。

先选择载体与启动子，再递送正常 CRX

团队先用绿色荧光报告蛋白比较腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）2 型与 8 型载体。在第 140 天加入载体、10 天后检测时，AAV2 在 CRX 阳性细胞中的报告表达较高，随后被用于治疗构建。

为了使递送表达集中在目标细胞，研究者将 3 段人 CRX 启动子序列组合，置于正常 CRX 编码序列上游。报告蛋白实验显示，这一启动子使信号主要分布在感光细胞所在外层，CMV 启动子则产生更广泛的表达。

最终 AAV-CRX 在类器官第 120 天加入，I138fs48 模型比较每个类器官 1×10¹¹ 与 3×10¹¹ 个载体基因组。团队在第 150 和 180 天检测 CRX、视紫红质与视锥视蛋白，再延长培养观察效果。

表达部分恢复，并延续至第 300 天

基因补充后，I138fs48 类器官的 CRX RNA 与蛋白升高，视紫红质信号从第 150 天开始恢复，第 180 天分布更广。染色强度接近健康参照的一半，两种载体剂量的信号强度相近；长／中波敏感视锥视蛋白表达也部分恢复。

第 120 天用药后继续培养至第 300 天，研究者仍能检测到恢复表达的视紫红质和视锥视蛋白。在感光细胞层未见 cleaved caspase-3 染色，但长期培养的类器官内部出现较多凋亡信号，两个位置分别观察。

K88N 模型经同一基因补充策略处理后，视紫红质和视锥视蛋白也部分恢复。不同基因型的视锥恢复程度存在差别，作者将其与变异蛋白及结合对象的差异联系起来讨论。

单细胞测序检查哪些细胞发生变化

研究在第 200 天对健康、未处理患者和 AAV 处理的 I138fs48 类器官做单细胞测序，获得 40712 个细胞转录组。按已知标志分类后，三组主要细胞类型分布相近；视杆和视锥细胞可根据各自表达特征进一步比较。

患者视杆和视锥的表达谱与健康参照分开，处理细胞的分布部分向健康参照靠近。视蛋白及部分其他感光细胞相关转录本的恢复，与组织染色结果相呼应。分析同时保留了未完全恢复的表达差异。

组织、表达与培养时点共同评价基因补充

这项研究把家族配对类器官、载体转导、启动子选择、组织染色和单细胞测序串成评价流程。基因补充的检测终点集中在感光细胞成熟与表达，既比较不同显性变异，也观察较长期培养中的变化。

作者提出继续确定剂量与干预时间窗，并在后续模型中评价长期增加 CRX 表达的影响。视锥恢复仍有改进空间，载体对相应细胞的转导能力是进一步优化的方向。