模型发育阶段决定能观察什么变化
加拿大圭尔夫大学团队在 Current Protocols 介绍了基于人多能干细胞的脑类器官评价方法。文章以诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）生成的模型为主要材料，将细胞增殖与分化检测、钙成像和微电极阵列记录结合，用于观察化合物对神经发育和功能的影响。
文中说明，培养不足 30 天的模型主要由增殖中的神经前体组成；30 天后逐步出现已退出细胞周期的神经元，约 120 天可观察较成熟的电生理特征。胶质细胞通常从培养 2–3 个月开始出现，模型的组成与神经活动因此随培养时间改变。
培养方案也分阶段调整生长因子：第 6 天起使用 bFGF 和 EGF，第 25 天转为 BDNF 与 NT-3，第 43 天后使用不补充这些生长因子的神经培养液。后续评价时间按所研究的发育过程或神经功能选择。
EdU 标记用于追踪增殖细胞的分化
EdU（ethynyl deoxyuridine）是一种胸苷类似物，可在 DNA 合成时掺入新生 DNA。文章采用 20 μM EdU 标记 2 小时，随后在不同时间观察已标记细胞，并配合细胞类型标志染色，分析神经前体增殖及其后续分化。
即时或较短时间观察侧重增殖活动，较长间隔则用于分析已标记细胞出现的分化标志。文中以 EdU 与 DCX 共染展示神经元分化，同时用 SOX2、Ki67、MAP2 和 GFAP 等标志描述模型中的前体、增殖细胞、神经元与胶质细胞。
钙成像记录单细胞活动的变化
活细胞钙成像使用 Fluo-4 AM 荧光指示剂，连续记录钙相关荧光。作者给出的示例采样频率为 2 Hz，通常记录 3–5 分钟，再分析各细胞信号的频率、幅度、持续时间及同步性。
文章以钾通道阻断剂 4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）作为活动调节示例：先记录基线，再以 100 μM 4-AP 处理 5 分钟后重复记录。分析用每个细胞的最低荧光或刺激前基线归一化，比较处理前后的相对荧光变化。
钙成像能够定位到单个细胞，但染料会逐渐洗脱，也可能产生毒性，通常不适合在同一模型上跨多天反复测量。检测结果反映钙信号，后续电活动记录提供另一类功能信息。
微电极阵列记录电活动和区域同步性
微电极阵列（microelectrode array，MEA）通过与模型接触的多个电极记录不同区域的电活动。文章使用 6 孔 CytoView 板和 Maestro Edge 系统，先记录 5–10 分钟基线，再加入 4-AP 后比较神经活动；分析指标包括放电频率、簇发放电和多个电极的同步活动。簇发放电指短时间内连续出现的放电。
图 6 展示培养第 160 天的模型：4-AP 处理后，多个电极检测到同步活动。MEA 还可在类器官发育过程中连续安排测量，追踪自发神经活动的出现及化合物处理后的变化。
这篇文章提供的是神经毒性评价所需的培养与检测方法，4-AP 主要用于演示功能变化。作者同时指出，起始 iPSC 细胞系和培养批次会造成变异，成熟模型还可能因氧和营养扩散受限形成中心坏死，这些特征会影响不同实验之间的比较。
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