反义寡核苷酸改善视网膜类器官的 CEP290 剪接与纤毛形成

同一 CEP290 变异在不同细胞中的异常剪接程度不同

CEP290 的一种内含子变异会让本应移除的序列进入成熟 RNA，产生异常剪接。英国团队在 Cell Stem Cell 报道一项患者细胞研究，利用三维视网膜类器官检验这种变化及针对它的反义寡核苷酸。

细胞来自 1 名 39 岁、携带 CEP290 c.2991+1665A>G 纯合变异的男性患者。团队从皮肤成纤维细胞建立诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC），挑选 2 个克隆，再分化为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）与三维视杯。

正确剪接的 CEP290 转录本约占患者成纤维细胞总量的 40%，在 RPE 中约占 50%，在视杯中则只占 10%–20%。随着感光细胞分化，异常剪接增加，同时出现较明显的纤毛缺陷。

类器官保留分化过程，也显示纤毛缺陷

患者细胞能够形成色素上皮和视杯。视杯在长期培养中出现分层结构，并产生表达杆状、锥状感光细胞标志的细胞；第 21 周可观察内节、连接纤毛及部分外节样结构。

正常视杯中，CEP290 定位于连接纤毛基底部；患者视杯在这一位置的信号明显减少。患者细胞形成纤毛的比例较低，较晚阶段的纤毛长度也缩短。

与成纤维细胞和 RPE 相比，类器官把同一变异放在感光细胞分化的背景中，使研究者能够观察到更强的异常剪接及其相关变化。

morpholino 针对异常剪接位点设计

团队设计了一条 25 个核苷酸的反义 morpholino，靶向变异附近的异常剪接位点，并以不靶向 CEP290 的标准序列作为对照。morpholino 是一种经化学修饰的反义寡核苷酸。

成纤维细胞中，10 μM 及以上浓度在 48 小时后提高正确剪接；10 μM 处理的作用到第 9 天仍可检测，正确剪接产物占总转录本的比例超过 80%。

视杯处理从第 13 周开始，每 3–4 天加入 morpholino，持续 4 周。荧光标记对照序列在 48 小时后能够进入多个细胞层，为三维组织中的递送提供观察依据。

处理后，克隆 1 视杯的正确剪接转录本比例超过 50%，克隆 2 最高约为 70%。这 2 个克隆来自同一患者。

剪接改善伴随纤毛与蛋白定位变化

视杯中，morpholino 同时增加纤毛数量和长度。成纤维细胞的纤毛形成比例增加，长度没有相同变化；RPE 的长度增加达到显著，形成比例增加则未达到显著。

CEP290 蛋白表达及其纤毛基底部定位也改善。团队进一步检测 RPGR：患者视杯中，RPGR 在连接纤毛处的定位减少；针对 CEP290 的处理提高了这一定位信号。

这项研究把 RNA 剪接、蛋白表达和纤毛结构连接为一组检测指标。视杯中的蛋白定位检测包括每条件 3 个重复，分别统计至少 45 或 50 条纤毛；这些重复与纤毛计数各有独立分母。

在患者感光细胞模型中检验序列特异性干预

作者指出，这类反义设计依赖具体 RNA 序列，而既有动物模型的致病变异与患者不同。患者来源的感光细胞模型因此用于直接测试对应序列下的剪接反应及纤毛变化。

本文模型来自 1 名患者、2 个克隆，干预在感光细胞前体形成阶段开始。其核心终点是正确剪接、CEP290 表达、纤毛形成以及相关蛋白定位。