选择性靶向需要同时比较不同转录本
C9orf72 重复扩增可以产生带重复序列的 RNA 及相关二肽重复蛋白，同时该基因也编码具有正常功能的蛋白。2022 年，Molecular Therapy - Nucleic Acids 发表了 WVE-004 的临床前研究，检验反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）能否优先降低与重复扩增相关的转录本。
WVE-004 的靶向位置可用于识别 V1 和 V3 前体 RNA，而主要贡献正常蛋白表达的 V2 转录本具有不同结构。团队在人源运动神经元中以 V3 作为主要重复相关指标，同时检测包括 V3 在内的全部转录本。
患者神经元在自由摄取条件下接受处理
运动神经元来自一个携带 C9orf72 重复扩增的肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）患者细胞系。研究将诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）定向分化为脊髓运动神经元，并在早期分化阶段冻存。
实验将冻存细胞解冻到 12 孔培养板，第 7 天加入 WVE-004 或非靶向寡核苷酸，第 14 天收取细胞。药物使用自由摄取条件，最高浓度为 10 μM；中间还向培养孔加入神经营养因子。
定量 PCR 分别使用 V3 与全部转录本探针，并以 HPRT1 表达归一化。两类检测来自同一模型，用于比较剂量反应和转录本选择性。
V3 的下降幅度大于全部转录本
V3 随 WVE-004 浓度提高而下降，拟合半数抑制浓度为 201.7 nM。10 μM 条件下，V3 平均下降 98.1%，全部转录本平均下降 65.7%。全部转录本本身包含 V3，两个指标分别报告。
图中 V3 浓度反应与高剂量比较标记 3 个重复，全部转录本检测为 2–3 个重复。这些检测反映一个患者背景内的实验重复。
外周血细胞补充活力与炎症反应检测
团队另用 3 名供者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），设置 0.1–30 μM WVE-004、阴性对照及可诱导炎症反应的 ODN 2216。每孔加入 40 万个细胞，处理 24 小时后采集上清，同时检测 ATP 活力。
在最高 30 μM 浓度下，ATP 活力仍高于论文用于判定细胞毒性的 80% 阈值。多种细胞因子的分泌与阴性对照相近；另一些因子在最高剂量下高于阴性对照，但仍明显低于 ODN 2216 阳性对照。
原研究还在转基因小鼠中观察了分布、转录本抑制、二肽重复蛋白和持续时间。患者运动神经元实验提供转录本选择性数据，血细胞实验补充短期反应，两类人源检测各有明确的材料与指标。