把两类引导 RNA 放进同一递送构建体
2025 年，Nature Communications 报道了一项针对 C9orf72 重复 RNA 的 CasRx 研究。团队利用 CasRx 能加工引导 RNA 阵列的特点，在一个构建体中加入两个方向的靶向序列，希望同时降低正义与反义重复 RNA。
团队先在 HEK293T 细胞中用重复序列与发光报告系统筛选引导 RNA。经过单向及双向构建体比较，选出靶向正义转录本的 guide 10 和靶向反义转录本的 guide 17，继续进入患者细胞实验。
靶向正义转录本的引导 RNA 靶向第一内含子内重复序列上游的位置。该设计针对带重复序列的 V1 和 V3 前体 RNA，保留不含相应重复序列的 V2。
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皮层样神经元先用于检验靶向效率
团队使用 3 个独立 C9orf72 患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）系，通过可诱导 NGN2 表达快速分化为皮层样神经元。分化开始时加入含 CasRx 和引导 RNA 的慢病毒，第 5 天分选已转导细胞，再提取 RNA 与蛋白。
靶向正义转录本的引导 RNA 可使重复相关转录本下降约 40%，幅度随细胞系而变化。靶向反义转录本的 guide 11 与 guide 17 分别使相应 RNA 下降约 32% 和 73%，V2 未下降。靶向正义转录本的引导 RNA 处理后，polyGP 和 polyGA 二肽重复蛋白也下降约 60%。
这些蛋白实验使用 3 个患者细胞系，其中一个细胞系有 3 次独立诱导，另外两个各有 1 次诱导。论文未能用相应检测测出反义链来源的特异二肽重复蛋白，因此未给出其降低幅度。
活力与转录组检测补充短期反应
团队在两个患者背景中，于转导后第 5 天检测活力，没有显著下降，其中一个背景呈下降趋势。随后对一个患者细胞系的 3 次独立诱导做 RNA 测序，每样本约 2000 万条序列。
测序确认正向靶向降低带重复序列的转录本，而不含重复序列的类别保留。在这一检测深度和分析条件下，未记录到其他显著差异表达基因；反义重复 RNA 本身未被 RNA 测序可靠检测，靶向效率由更敏感的定量 PCR 确认。
作者将短期结果作为继续研究的依据，同时提出需要更深入、灵敏的分析检验低水平脱靶变化。
脊髓神经元用于谷氨酸应激比较
功能实验采用另一条脊髓神经元分化流程。分化第 12 天通过核转染加入 CasRx 构建体，继续培养 20 天后，以 10 μM 谷氨酸处理 4 小时。碘化丙啶阳性细胞核比例用于检测死亡，Alamar Blue 用于检测活力。
该比较涉及每类 6 个细胞系。患者神经元中，单独使用 guide 10 或 guide 17 都减轻应激后的细胞死亡；双引导 RNA 构建体也显示保护作用。对照神经元的存活没有因两类单向构建体出现显著变化。
剪接指标则显示方向差异：靶向反义转录本的 guide 17 可减少 STMN2 和 HDGFL2 的隐蔽外显子纳入，guide 10 没有同样的效果。双向构建体也改善相关剪接指标。
皮层样与脊髓神经元分别评价靶向和保护作用
原研究还在斑马鱼和两个小鼠模型中检验递送与作用。患者皮层样神经元提供短期靶向、蛋白和活力数据，患者脊髓神经元提供应激及剪接数据，两条人源实验路线的分化、递送和观察时间各自设定。
作者指出，持续表达 CasRx 可能涉及免疫反应，神经系统中的递送范围也需要改进。人源细胞实验已分别检验两类 RNA 的降低、二肽重复蛋白变化、谷氨酸损伤及剪接指标，单独靶向与双向靶向在这些检测中呈现不同结果。