抑制 HDAC6 改善 ALS 患者运动神经元中的 TDP-43 异常与轴突运输

3 位患者的细胞用于观察早期 TDP-43 异常

TDP-43 蛋白的异常分布和累积是肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的重要病理特征。比利时鲁汶大学（KU Leuven）团队在 The EMBO Journal 发表研究，用患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）分化运动神经元，将蛋白变化、轴突运输和药物干预放在同一个人源模型中考察。

研究纳入 3 位携带 TARDBP 变异的 ALS 患者和 3 位健康供者。补充表列出的患者变异分别为 G287S、N390S，以及同时携带 A382T 和 C9ORF72 重复扩增。团队另纠正 G287S 变异，建立同一遗传背景的参照细胞。

第 38 天的培养物中，运动神经元标志阳性比例约为 70%–85%，患者与健康细胞的分化效率没有显著差异。两组细胞均能产生自发及诱发动作电位，患者培养物在这一阶段也未出现明显的细胞死亡。

不溶性 TDP-43 增多，胞质分布发生变化

研究者先按溶解性分离蛋白，再用免疫印迹检测。患者细胞中的 TDP-43 总量升高，主要变化集中在不溶性组分；35 kDa 和 25 kDa 的 C 端片段也增加，可溶性 TDP-43 水平则与健康细胞相近。

成像和细胞核、胞质分离实验进一步显示，患者运动神经元的胞质 TDP-43 增多，核／胞质荧光比下降。总核蛋白检测中的 TDP-43 没有显著改变，磷酸化 TDP-43 则在患者细胞中增加。研究在常规共聚焦成像中未看到明显的大型 TDP-43 聚集体。

团队在 N390S 患者细胞中分别标记正常和变异的 TARDBP 等位基因。红色荧光标签使两种蛋白能够单独追踪：胞质异常分布和较高的磷酸化主要出现在变异蛋白上，正常蛋白仍以细胞核定位为主。

线粒体移动减少，基因纠正恢复相关指标

研究者用 MitoTracker 标记线粒体并进行活细胞录像，从时间—距离图中区分移动和静止对象。患者细胞中，移动线粒体的比例与数量降低，每 100 μm 神经突上的静止线粒体增多，线粒体总数没有改变。

基因纠正细胞的 TDP-43 总量、不溶性组分、C 端片段和磷酸化水平向健康参照恢复，胞质累积也减少。移动线粒体的比例、数量和静止线粒体数量同样恢复。这个同背景比较将蛋白异常与运输变化联系到被纠正的具体变异。

Tubastatin A 改善 TDP-43 异常与线粒体运输

团队选择组蛋白去乙酰化酶 6（histone deacetylase 6，HDAC6）抑制剂 Tubastatin A，处理运动神经元 12 小时。患者细胞中升高的 TDP-43 总量、不溶性全长蛋白及 C 端片段减少；可溶性蛋白水平没有出现相同变化。健康参照中的相关蛋白指标基本保持。

药物还改善了患者细胞的核／胞质分布和异常磷酸化。在等位基因标记实验中，变异蛋白的胞质水平降低，正常蛋白的核内水平适度增加；两种蛋白的变化分别分析。

同样的 12 小时处理恢复了移动线粒体的比例和数量，并减少静止线粒体。运输分析合并 3 次独立分化，未用药健康与患者组分别分析 94 和 159 条神经突，用药后分别为 145 和 235 条。

TDP-43 相互作用谱随药物处理改变

为了进一步了解变异蛋白影响的过程，研究者富集带标签的 TDP-43，再做定量质谱，获得接近 2000 个潜在相互作用蛋白。与变异 TDP-43 相互作用的蛋白更多位于胞质，与正常 TDP-43 相互作用的蛋白则更多位于细胞核；参与轴突运输和蛋白稳态的部分相互作用蛋白也发生变化。

Tubastatin A 处理后，变异蛋白的相互作用谱部分向正常蛋白靠近，与定位和运输实验的改善相呼应。作者同时指出，HDAC6 抑制的具体保护机制仍只得到部分解释：微管乙酰化、蛋白降解和其他 HDAC6 底物都可能参与。

模型关注早期蛋白与运输变化

这项研究提供了可用于药物比较的一组细胞指标：TDP-43 的溶解性、片段、磷酸化和亚细胞分布，以及轴突内线粒体的移动情况。相同遗传背景的基因纠正和短时间药物干预分别检验了表型的可逆性。

模型覆盖 3 位患者，其中 1 位还携带 C9ORF72 重复扩增。所观察的阶段以早期蛋白异常和运输缺陷为主，细胞尚未出现明显死亡。作者据此提出继续探索能够进入中枢神经系统的 HDAC6 抑制策略。