Apamin 与 XE991 增加 ALS 运动神经元的神经突长度和突触数量

患者运动神经元随培养时间出现不同变化

调节神经元兴奋性是肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）药物研究的一条路线。德国牵头团队在 EMBO Molecular Medicine 报道一项研究，结合患者细胞、药物、光刺激和组学分析，检验恢复神经元活动能否改善突触及细胞状态。

主要模型包括 3 名 C9orf72 重复扩增患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）及 3 个对照细胞系。对照中 2 个来自健康供者，另 1 个是纠正 C9orf72 变异的同遗传背景细胞。

培养第 21 天，体系中约一半细胞是神经元，其中约 84% 呈胆碱乙酰转移酶阳性。患者细胞已出现 RNA 聚集灶和核周蛋白聚集物，但运动神经元数量到第 56 天仍与对照相近，第 70 天才出现明显减少。

转录因子 CREB（cAMP response element-binding protein）的磷酸化随时间改变：患者细胞早期高于对照，随后逐渐下降，第 56 天低于健康对照。突触相关基因表达和突触接触数量也减少，提示研究需要把培养时间纳入药物比较。

初筛同时考察刺激频率和药物剂量

团队先在表达 poly(GA) 聚集蛋白的原代大鼠皮层神经元中测试活动调节。连续 4 天、1 Hz 光刺激减少聚集负荷；10 Hz 刺激虽提高 CREB 磷酸化，却增加聚集负荷。

药物初筛比较 6 种钾通道阻断剂，每种在不同浓度下处理 7 天。靶向小电导钙激活钾（small-conductance calcium-activated potassium，SK）通道的 Apamin 500 nM，以及靶向 KCNQ/Kv7 通道的 XE991 10 μM，减少聚集蛋白的荧光信号，这一变化随后用单细胞成像与活化 caspase-3 检测确认。

XE991 增至 100 μM 时，原代神经元存活反而降低。研究因此同时记录有效条件和较高剂量的不利反应。

两种阻断剂改善患者细胞的神经突和聚集物

Apamin 与 XE991 随后进入患者来源运动神经元实验，从培养第 63 天处理到第 70 天，每 2 天更换一半培养液。团队记录神经突长度、RNA 聚集灶、蛋白聚集和细胞凋亡指标。

两种处理都增加 C9orf72 患者运动神经元的神经突长度，减少活化 caspase-3 阳性细胞，并降低 p62 聚集负荷和核周聚集物的大小。RNA 聚集灶数量也减少，C9orf72 的表达量未改变。

神经突、p62 聚集负荷和 RNA 聚集灶的比较使用 3 个患者细胞系，各有 3 次独立处理；部分聚集物大小及磷酸化检测则集中在其中 1 个细胞系。

组学与成像共同记录突触反应

7 天药物处理后的转录组比较，使用 2 个患者细胞系。两种处理共同改变一组受 CREB 调节的基因，其中 263 个共同变化基因涉及神经元活动、突触及自噬相关过程。

成像显示，两种药物均提高 CREB 磷酸化，并增加 Homer1b/c 阳性突触接触。突触数量向健康对照接近，但仍低于对照；健康细胞接受同样处理时，突触数量没有显著变化。

蛋白组记录到 589 种蛋白发生显著变化，其中 340 种变化为两种处理共有。上调蛋白包括与突触活动及结构相关的类别，与成像观察到的突触变化相互补充。

TBK1 模型补充比较，部分指标反应不同

团队还使用 1 个 TBK1 变异患者背景。Apamin 与 XE991 均增加神经突长度、减少 p62 聚集负荷，并提高 CREB 磷酸化及兴奋性突触数量。核周聚集物缩小在 Apamin 组的统计检验中未达到显著，P 值为 0.07。

这项研究的药物与光刺激数据采用盲法分析。原代皮层神经元筛选和患者运动神经元验证各有独立用途，而刺激频率、剂量和培养阶段的差异直接影响实验结果。