人视网膜组织分层的苏木精–伊红染色显微图像。
人视网膜组织分层的苏木精–伊红染色显微图像。(Librepath / Wikimedia Commons;CC BY-SA 3.0)

先减少起始细胞团带来的变异

类器官大小、形状和细胞组成的差异,会影响后续模型比较。美国印第安纳大学(Indiana University)等团队在 Proceedings of the National Academy of Sciences 报告,把质量控制提前到初始细胞团,检查定量聚集能否提高视网膜类器官的一致性。

传统方法常把整片干细胞集落分离后形成细胞团,集落大小的差异会进入后续培养。研究改为从已知数量的单细胞重新聚集,比较每孔 250、500、1,000、2,000、4,000 和 8,000 个细胞。在第 3 天和第 6 天,标准化流程生成的细胞团在面积和圆度上更一致;最初结果还在 H9 和 PGP1 两条额外细胞系复核。

初始细胞数也影响视网膜命运。以 SIX6 报告标志判断,250 或 500 个细胞形成的细胞团较难全部进入视网膜方向,而 1,000–8,000 个细胞范围内可得到 100% 的标志阳性结果。综合一致性和细胞消耗,后续采用每团 2,000 个细胞。该密度比较为 4 次生物重复。

统一大小仍不够,早期 BMP 信号决定形成效率

研究在第 6 天比较骨形态发生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)与 BMP 通路抑制剂 LDN-193189,检验细胞团处理和分化信号的共同作用。到第 25 天,传统方法不加 BMP4 时,SIX6 阳性类器官比例为 38.67±6.12%;传统方法加 BMP4 后提高到 84.33±2.91%。

标准化流程不加 BMP4 时,阳性比例为 51.67±20.93%;加入 BMP4 后则在全部实验中达到 100%。相反,LDN-193189 处理使两种流程都不再出现 SIX6 阳性类器官,未进入视网膜方向的群体呈现前脑相关标志。图 3 的定量来自 3 次生物重复,误差为均值标准误。

这些比较表明,减少初始大小变异和调节早期分化信号共同影响视网膜形成效率。标准化细胞团不加 BMP4 时,形成比例仍有较大波动;BMP 通路阻断则使细胞转向前脑相关谱系。

6 条细胞系复核,按标志判定形成效率

后续跨系验证覆盖 H7、H9、IMR90-4、WTC11、PGP1 和 JM2019,包含胚胎干细胞与诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)、不同性别来源,也包含原本较难形成视网膜类器官的 WTC11。传统方法形成效率随细胞系而变,约从 30% 到 80% 以上;标准化流程加入 BMP4 后,6 条细胞系都达到本文 VSX2 标志判定的 100%。

这一数字描述研究条件下按视网膜谱系标志判定的形成效率。团队计算连续切片中 VSX2 阳性切片数占 DAPI 染色切片数的比例,每条细胞系有 3 次生物重复;这一判定与类器官内部各种细胞的比例分别评价。

作者同时比较第 6 天未处理细胞团,与第 8 天 BMP4 或 LDN-193189 处理后的早期群体,观察到视网膜与前脑相关表达已经分开。第 25 天的身份确认帮助检查这些早期样本的后续去向,使模型可用于较早的发育事件研究。

早期分化加快,后期部分表达接近

标准化组第 30 天的 BRN3b 相关神经节细胞分化更明显,光感受器前体标志 CRX 也更早出现。但 BRN3b 表达到第 80 天时传统组已追近;CRX 和 OTX2 到第 90 天不再有显著差异。这些比较显示,标准化流程主要使相关标志更早出现,部分后期表达水平随后接近。

第 150 天,标准化组还出现更明显的光感受器节段和视紫红质表达。作者在主文报告,该组全部观察类器官都有环绕表面的完整刷状缘;传统组完整刷状缘约为 6.00±3.79%,另有 26.33±15.30% 仅部分形成。这里的结构和标志结果仍需与光反应等功能测量分别判断。

起始干细胞是否已自发分化、细胞团大小、转移时机及 BMP4 试剂来源,都会影响一致性。研究的药物开发用途,是为后续筛选减少模型本身的波动,并帮助选择可比较的培养阶段;本文并未测定候选治疗药物的预测性能。

来源与延伸阅读

  1. A highly reproducible and efficient method for retinal organoid differentiation from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2024. doi:10.1073/pnas.2317285121 ↗