HCN 药理对照检验视网膜类器官视锥的光反应

美国研究解读2022-01-31

人视网膜组织分层的苏木精–伊红染色显微图像。（Librepath / Wikimedia Commons；CC BY-SA 3.0）

用电记录检验视锥的内源光反应

视网膜类器官用于药物和基因治疗研究，需要在标志表达之外检查光感受器功能。2022 年，美国威斯康星大学麦迪逊分校（University of Wisconsin–Madison）团队在 Cell Stem Cell 报告，比较人多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）来源类器官视锥与成年猕猴中央凹视锥，并用药理对照检查参与光反应的离子通道。

研究使用 4 条 hPSC 系，主要功能实验选择培养 240–270 天、已出现内外节的第 3 阶段类器官。记录时没有额外加入 9-顺式视黄醛（9-cis retinal），但此前培养中的 B27 补充物持续提供维生素 A，这仍是有视黄类物质供应的培养背景。

图 1 统计的 107 个被靶向记录视锥中，36 个对分型闪光作出响应，71 个未响应。响应包括光照后的膜电位超极化及恢复，并具有不同波长敏感性；同阶段视杆没有可测的内源光反应。这里的分母是细胞数，全研究跨不同发育阶段共使用 23 个类器官。

与成年猕猴相比，平均光反应仍较弱、较慢

暗适应后，类器官视锥闪光响应的平均峰值为 2.51±0.45 mV（27 个细胞），猕猴中央凹视锥为 9.37±0.56 mV（14 个细胞）；达峰时间分别为 127.57±9.69 ms 和 62.2±2.77 ms。误差为均值标准误。部分单细胞响应接近猕猴，但总体幅度较小、速度较慢。

这一参照还有选择条件：猕猴电流钳记录纳入的细胞，分型闪光响应需超过 6 mV。两类样本的平均值应连同入选标准理解。提高背景亮度后，类器官视锥的响应增益下降约 50%，显示其还能随照明条件调节敏感性。

膜电容在两类视锥中接近，但其他膜性质仍有差别：类器官视锥静息电位为−34±2.8 mV（19 个细胞），猕猴为−51.5±2.7 mV（9 个细胞），前者较去极化；膜时间常数也较长。作者认为，这些差异可能参与解释光响应的幅度和速度差别，提示需要同时检查各项膜性质。

HCN 阻断与洗脱检查通道的功能贡献

研究随后检查超极化激活的环核苷酸门控（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN）通道。加入非特异性 HCN 阻断剂氯化铯（1 mM）后，视锥在超极化电压下的内向电流减小，洗脱后恢复。图 3D–G 呈现的是一个代表性细胞的处理前、处理后和洗脱记录。

另一阻断剂 ZD7288 在主文方法中的浓度为 0.1 mM。主文报告，它几乎消除了相应内向电流，还降低光响应幅度、减慢衰减，而不影响激活阶段。这些比较支持 HCN 参与塑造视锥光反应，可用来检验模型中通道与电活动是否衔接。

本文的药理比较用于功能鉴别，主文未给出这部分实验的独立重复数。基础电流–电压曲线中的 15 个类器官视锥，属于另一项比较的样本量。

功能成熟存在时间窗口，培养更久未必更好

团队还在 WA09 胚胎干细胞系中比较约 170–310 天的 6 个发育阶段。视锥约在 200–210 天开始出现内源光反应，250–260 天的响应比例和敏感性最高，300–310 天则下降。峰值幅度在 250–260 天为 5.97±1.20 mV（10 个细胞），300–310 天为 0.42±0.17 mV（3 个细胞）。这是不同阶段分别取样的比较，未连续追踪同一个视锥。

这些结果为选择功能检测时间提供了依据，也说明外观成熟不能代替电生理质控。类器官缺少均一相邻的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE），外节膜盘仍较紊乱，视杆功能也未检出；其视杆与视锥比例更接近中央凹旁区。

电镜还能看到光感受器末端的带状突触。不过，单张切片不能确定视锥与双极、水平细胞是否形成典型三联体连接。单细胞光反应、离子通道功能和下游回路传递仍是不同的质控问题，后续治疗研究应选择与作用环节对应的读数。