放大培养要同时检查光感受器组成与结构
视网膜类器官用于疾病与药物研究时,研究者需要足够的目标细胞,也需要这些细胞保留合适的成熟结构。2018 年,英国伦敦大学学院眼科研究所(UCL Institute of Ophthalmology)等团队在 Stem Cell Research & Therapy 比较搅拌生物反应器与静态培养,检查放大培养是否同时改善模型质量。
研究使用 H9 人胚胎干细胞和 IMR90-4 人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)等来源。形成神经视网膜囊后,样本进入 100 mL 生物反应器或 100 mm 超低黏附培养皿;反应器持续以 22 rpm 搅拌。2 种条件下都可形成视杆、视锥及其他视网膜细胞。
2 组类器官大小均有变化,部分组织会出现玫瑰花样排列或失去有序结构,生物反应器中还偶尔发生类器官融合。放大培养后,组织大小、形态及偶发融合仍存在差异。
16 周时多种光感受器标志比例提高
标志出现的时间也有差异。反应器组在第 11 周开始出现视紫红质(RHODOPSIN)阳性视杆,静态组到第 15 周才出现;至第 16 周,2 种方法都表达视杆和视锥的成熟相关标志。这是标志出现时间的比较。
第 16 周,生物反应器组 RECOVERIN 阳性细胞比例为 68.17%±6.15%,静态组为 43.53%±4.47%。每次流式实验合并 50 个类器官,比较来自 3 次独立实验,误差为均值标准误。
RECOVERIN 也可在部分双极细胞中表达,研究因此增加双标。CD133/CD73 双阳性比例为 6.50%±0.86% 与 2.14%±0.57%(4 次独立实验);RECOVERIN/CD73 双阳性为 11.87%±1.88% 与 1.38%±0.59%(3 次独立实验),均为反应器组更高。16 周时大部分光感受器仍是前体,成熟标志阳性的群体只占其中一部分。
组织分层也有改善:在每次实验随机取 10 个神经上皮区域、共 3 次独立实验的比较中,具有 3 层样结构的比例在反应器组为 53.33%±6.66%,静态组为 20%±11.55%;1 层或 2 层区域的减少则不显著。

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总体死细胞未减少,局部凋亡和早期增殖有变化
第 16 周以 SYTOX Blue 检测全部解离细胞时,2 组死细胞比例无显著差异:静态组 15.94%±1.36%,反应器组 16.86%±1.58%,每次仍合并 50 个类器官,来自 5 次独立实验。
但在神经上皮局部区域,反应器组裂解型半胱天冬酶 3(cleaved caspase-3)阳性细胞更少;在较早的第 8 周,Ki67 阳性增殖细胞更多。这 2 项区域比较各来自 3 次独立实验、每次 10 个区域或图像。作者据此提出,早期增殖与后期局部凋亡减少可能共同增加光感受器,但其解释不同于全组织死细胞比例。
33 周结构反向,长期搅拌仍需优化
第 16 周的电镜可见连接纤毛、初生外节样结构及带状突触,反应器组相应结构更密集。不过,继续培养到第 33 周,发达的刷状边仅在静态组出现;内节线粒体与外节相关标记和扫描电镜也显示静态组保留较好。该晚期比较主文注明 50 个类器官、4 次独立实验。
作者认为,脆弱结构长期暴露于搅拌剪切可能参与这一变化,但尚未直接证明机制。后续需要在目标细胞比例、培养负担与外节保留之间优化搅拌和供液条件。本研究比较的是培养质量,未测光反应或候选药物效应。