ALS 患者运动神经元对 MG132 应激更易受损

中国研究解读2018-11-15

患者与非运动神经元对照一起限定模型表型

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的体外药物研究需要可重复观察的细胞表型。华中科技大学同济医院团队在 Stem Cell Research & Therapy 报告，用 1 位 TAR DNA 结合蛋白 43（TAR DNA-binding protein 43，TDP43）G298S 变异患者和 2 位散发性 ALS 患者的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）分化运动神经元，检查早期病理及其对化学应激的反应。

患者与正常细胞都能形成神经元及运动神经元标志阳性的群体，分化效率没有显著差异。研究同时生成非运动神经元作为细胞类型对照，帮助判断后续异常是否只是培养体系普遍受损。TDP43-1 和 TDP43-2 是同一突变患者的 2 个细胞克隆，不能作为 2 位独立患者计数。

在普通免疫荧光下，散发患者细胞的 TDP43 仍主要位于细胞核；免疫电镜则显示较细小的胞质异常。早期总 TDP43 蛋白水平与正常对照没有显著差异。不同检测方法的可见程度，因而需要与总蛋白量分别解释。

神经丝异常伴随突起中的线粒体减少

运动神经元铺板后第 4、7、10 天的比较显示，患者细胞的神经丝包涵体随培养时间增加；非运动神经元中相应包涵体较少。研究把局部染色强度约为周围的 3 倍的聚集作为包涵体判定依据，并在神经丝定量中每组至少检查 500 条突起。

线粒体常集中在神经丝包涵体内或附近，患者运动神经元突起中的线粒体密度低于正常对照。该项测量从细胞体起的 50 μm 突起区段计数，并抽取 150 个神经元；非运动神经元未显示相同密度变化。

神经丝异常与细胞器分布变化为干预评价提供了 2 类可观察指标。共定位结果显示两者在空间上相关，尚未确定其全部因果关系。

MG132 处理使运动神经元的差异更加明显

研究随后使用蛋白酶体抑制剂 MG132，检验模型能否对蛋白清除系统受扰动表现出不同反应。第 21 天分离铺板后的运动神经元继续培养 4 天，再接受 0.6 μM MG132 处理 24 小时。此时正常细胞也出现 TDP43 位置改变；患者与正常模型的差别还需结合其他指标判断。

相同处理后，患者运动神经元中含神经丝包涵体的细胞体和突起比例较高，培养液乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平也较高，活化 caspase-3 阳性细胞增加。三类指标分别反映细胞结构、损伤和凋亡相关变化，共同支持患者运动神经元更易受到 MG132 应激影响。

非运动神经元对照没有呈现同样的神经丝、LDH 和 caspase-3 差异，提示本实验中的易损性与细胞类型有关。

MG132 处理后，运动与非运动神经元的 TDP43 定位、神经丝包涵体和细胞损伤比较。（Xuejiao Sun / Stem Cell Research & Therapy, 2018, Fig. 7；CC BY 4.0）

药物筛选前仍需确认表型在更多患者中稳定存在

本研究用 MG132 诱发应激表型。研究建立的是可比较的应激反应窗口，后续候选干预可围绕神经丝、细胞器分布和损伤终点设计检测。

目前患者范围为 1 位家族性相关变异和 2 位散发病例。主文及图 7 没有明确给出 MG132 比较的独立培养重复数，神经元或突起计数也不能替代独立培养数。因此，扩展到更多患者和批次，是判断这一表型能否稳定用于筛选的重要一步。

原论文另于 2019 年发布正式更正，说明文章未经共同作者 Hong Chen 同意投稿和发表；该作者要求不再列入作者名单，所有作者同意这一变更。更正未列出数据、图表或结论的修改。