转录组引导的 TARDBP 神经元候选筛选与双指标验证
将差异表达特征用于 CMap 排序，再分别用 ATP 活力与多电极阵列检验候选化合物。
用途与模型
- 研究用途
- 为 TARDBP 相关神经元表型寻找候选干预，并比较活力与电活动反应。
- 模型与细胞来源
- 同一健康男性供者背景的 A382T、G348C 纯合敲入 iPSC 与原细胞，分化为富集腹侧脊髓神经元的混合培养物。
- 方法版本
- 2025 年 A382T／G348C 同背景敲入细胞的 CMap、ATP 与 MEA 版本
- 实验形式
- 第 4 周转录组；96 孔 ATP 活力和 24 孔多电极阵列在第 5 周开始用药。
材料与平台
- 计算筛选
- DESeq2 以 FDR<0.05 确定表达变化；CMap 输入上下调基因，优先评分<−85 的化合物，选 6 个实测。
- ATP 活力条件
- 每孔 15000 个前体细胞；第 5 周撤去 BDNF、CNTF、IGF-1，候选 0.1／1 μM 处理 6 天，每 2 天换液，CellTiter-Glo 检测。
- 电活动条件
- 24 孔 MEA 保留神经营养因子，候选 1 μM 处理 6 天；人工脑脊液中平衡至少 1 小时，记录 5 分钟自发活动。
- 靶向验证
- 1 μM MLN4924 处理 6 天；第 2 周细胞免疫印迹，第 4 周细胞 PCR，检测 NEDD8 相关过程及 TDP-43。
测量指标与分析
- 差异表达基因与 CMap 连接评分
- 归一化 ATP 活力信号
- 每孔平均放电频率
- NEDD8 偶联蛋白及 NAE1
- TDP-43 RNA 和总蛋白
ATP 信号以各细胞系无营养因子溶剂组归一化；MEA 先计算每孔平均值再比较独立分化。蛋白实验分别分析游离 NEDD8、偶联蛋白与相关酶。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 计算排序后的 6 个候选做双剂量活力与单剂量电活动比较，同时加入既有 ALS 用药条件；MLN4924 另做相关蛋白检测。
- 测试范围
- 同一供者背景的 3 种细胞；RNA-seq 5 次独立分化，ATP 与 MEA 4 次独立分化，蛋白检测 3 次独立实验。
- 参照体系
- 各变异和同背景原细胞的 DMSO 组，利鲁唑、依达拉奉及苯丁酸钠／牛磺熊去氧胆酸组合。
- 研究结果
- 1 μM MLN4924 使原细胞和 A382T ATP 信号分别显著增加 29.3%、28.4%；G348C 增加 14.5% 未显著。A382T、G348C 平均放电频率分别显著增加 1.7、1.5 Hz。NEDD8 偶联蛋白的显著下降只见于 G348C。
适用条件与研究局限
- 活力与电活动实验的营养因子条件不同。
- 模型来自同一供者背景的工程化细胞，含部分其他神经或胶质细胞。
- TDP-43 RNA 和总蛋白未显著变化，具体功能改善机制仍待研究。
来源与原文
- Transcriptome-based screening in TARDBP/TDP-43 knock-in motor neurons identifies the NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924原始研究 · Scientific Reports · 2025-08-05