RPGR 缺失视网膜类器官的基因补充与定位检测
用同遗传背景视网膜类器官检测 RPGR 基因补充后的蛋白表达、修饰、纤毛定位和视紫红质分布。
用途与模型
- 研究用途
- 评价 RPGR 构建体在人光感受器细胞中的体外功能作用。
- 模型与细胞来源
- 健康成纤维细胞衍生 iPSC 与其 RPGR 第 10 外显子缺失细胞，分别形成正常和 RPGR 缺失视网膜类器官。
- 方法版本
- 2024 年同背景 RPGR 缺失与 AAV7m8 包装转基因版本
- 实验形式
- 三维类器官培养、基因补充处理与冷冻切片成像；蛋白和 RNA 检测并行。
材料与平台
- 模型与对照
- 正常与 RPGR 缺失的同遗传背景类器官；未处理缺失组与 AAV-RPGR 处理缺失组。
- 转基因构建体
- AAV7m8 包装、RK 启动子驱动的 RPGRORF15 构建体；第 135 天以每个类器官 3×10¹¹ 个载体基因组处理。
- 检测
- 定量 PCR、蛋白免疫检测、RPGR/ROOTLETIN/GT335/视紫红质染色和共聚焦成像。
测量指标与分析
- RPGRORF15 表达
- RPGR 连接纤毛定位
- RPGR 与 GT335 共定位
- 外核层视紫红质阳性像素比例
将处理组与同背景正常及未处理缺失组比较；成像用固定阈值定量共定位和外核层视紫红质错位，蛋白和 RNA 检测按相应内参归一化。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 第 135 天处理 RPGR 缺失类器官，约第 160 天检测转录、蛋白、修饰及定位；3 个实验组直接比较。
- 测试范围
- 图中各检测为 2–6 个类器官，正常和缺失模型来自同一遗传背景细胞系。
- 参照体系
- 正常类器官、未处理 RPGR 缺失类器官及 AAV-RPGR 处理组。
- 研究结果
- 处理恢复 RPGR 蛋白及连接纤毛定位，修饰相关信号接近正常组；视紫红质在外核层的异常积累减少。
适用条件与研究局限
- 采用单一遗传背景建立的缺失模型，未覆盖不同患者变异。
- 检测终点为蛋白表达、修饰和定位。
- AAV7m8 为本研究体外测试采用的包装衣壳。
来源与原文
- AAV-RPGR Gene Therapy Rescues Opsin Mislocalisation in a Human Retinal Organoid Model of RPGR-Associated X-Linked Retinitis Pigmentosa原始研究 · International Journal of Molecular Sciences · 2024-02-02