视网膜类器官的光遗传学候选定位与电流评价
用定位成像、光刺激膜片钳和应激检测比较视蛋白候选。
用途与模型
- 研究用途
- 比较光遗传学递送候选在感光细胞前体中的表达、功能和应激表型。
- 模型与细胞来源
- 1 株健康皮肤成纤维细胞来源 hiPSC2A 及其视网膜类器官。
- 方法版本
- 2018 年 hiPSC2A 类器官、5 种微生物视蛋白与培养约第 70 天的评价版本
- 实验形式
- 第 28 天分离组织，第 44 天 AAV 递送，约第 70 天开展感光细胞前体评价。
材料与平台
- 递送
- AAV2-7m8 载体，CAG 启动子驱动 GFP 融合蛋白；每类器官 5×10¹⁰病毒基因组。
- 候选
- eNpHR3.0、Jaws、hCatCh、ChrimsonR、ReaChR，配合仅 GFP 对照。
- 组织培养
- 第 44–50 天加入 DAPT 10 μM；第 70 天观察感光细胞前体，尚缺完整外节。
- 功能检测
- 双光子 930 nm 寻找表达细胞，膜片钳−60 mV；450/590 nm 刺激，光子通量 1×10¹⁶或 3.2×10¹⁷ photons·cm⁻²·s⁻¹。
- 应激
- 内质网/高尔基体定位、BiP 免疫染色，以及相关 RNA 定量。
测量指标与分析
- 细胞膜与细胞内蛋白定位
- 光诱导电流幅度与时间过程
- BiP 阳性细胞比例
- 应激相关 RNA 表达
同类器官阶段分别分析各候选的膜定位与光电流；RNA 和免疫成像采用各自生物重复，按相应比较检验。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 5 候选与 GFP 对照比较，结合不同光波长/强度及蛋白定位和应激指标。
- 测试范围
- 1 株 iPSC 背景；RNA 分析 4 生物重复，BiP 比较 3 重复；电流检测按各候选的记录细胞统计。
- 参照体系
- 仅 GFP、不同候选、2 档光强及蓝光/橙光。
- 研究结果
- 5 候选均产生光电流；hCatCh/ChrimsonR 更多细胞内分布。hCatCh 的 BiP 阳性比例增加，ChrimsonR 未显著；未观察到明显细胞死亡。
适用条件与研究局限
- 模型来自单一细胞背景，培养阶段尚缺完整感光细胞外节。
- RNA 表达、BiP 阳性及电流检测的样本层级不同。
- 成像和电生理终点分别反映蛋白定位、细胞应激与光响应。
来源与原文
- Optogenetic Light Sensors in Human Retinal Organoids原始研究 · Frontiers in Neuroscience · 2018-11-02