PRPF31 患者视网膜类器官的 AAV 递送与感光细胞评价
以患者、家属、无症状携带者和基因修复参照，评价正常 PRPF31 补充对视网膜细胞功能的影响。
用途与模型
- 研究用途
- 比较 PRPF31 基因递送后的感光细胞保留，以及色素上皮的屏障和吞噬功能。
- 模型与细胞来源
- 两位 PRPF31 相关视网膜色素变性患者的 iPSC；另有未患病家属、无症状变异携带者及修复/敲入克隆。
- 方法版本
- 2022 年两种 PRPF31 变异、RPE 并行表型与类器官退化前给药版本
- 实验形式
- 分别分化 RPE 单层与视网膜类器官；类器官长期培养至第 200 天。
材料与平台
- 视网膜类器官培养
- 第 28 天分离到低吸附 24 孔板，ProB27 加 10 ng/ml FGF2；第 35 天后移除 FGF2 并加血清和 Glutamax，第 84 天起使用不含维生素 A 的 B27。
- AAV 处理
- 第 85 天每孔 1 个类器官、50 µl 培养液，单次加入 4×10⁹载体基因组的 AAV2-7m8-CAG-PRPF31；次日补 50 µl 培养液，GFP 载体作参照。
- 感光细胞检测
- NRL、视紫红质、hCAR 及 DAPI 染色；每个类器官代表切片的四分之一区域手工计数，结合 PRPF31 免疫印迹。
- 并行 RPE 功能检测
- Transwell 培养中每周测跨上皮电阻并扣空白；每孔加 10⁶个 FITC 标记猪感光细胞外节片段，37°C 孵育 3 小时后，以台盼蓝淬灭区分表面附着与内吞信号。
测量指标与分析
- NRL 与 hCAR 阳性细胞占 DAPI 细胞比例
- 视紫红质和 PRPF31 蛋白表达
- 外层细胞密度及活化 caspase-3
- RPE 跨上皮电阻与外节片段吞噬
按供者及干预路径分别比较；感光细胞计数按类器官切片比例分析，RPE 功能在单层体系单独评价。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 两种患者变异分别比较家属参照、基因修复、iPSC 正常基因敲入和无症状携带者；第 85 天病毒递送后在第 175 天评价类器官。
- 测试范围
- 2 位患者，加 1 位未患病家属和 1 位无症状携带者的细胞系；感光细胞定量每条件至少 9 个类器官，来自至少 3 个独立分化批次。AAV 处理每次 6 个重复，文中数据代表 5 次独立实验。
- 参照体系
- 未患病家属、同遗传背景修复株、未处理患者及 GFP 载体。
- 研究结果
- AAV 处理后的第 175 天类器官约有 40% NRL 阳性视杆和 20% hCAR 阳性视锥，接近参照范围。iPSC 阶段正常 PRPF31 敲入改善 RPE 形态、跨上皮电阻和外节片段吞噬。
适用条件与研究局限
- 类器官给药在明显退化前开展，作者提出继续确定退化后的干预时间窗。
- 类器官未与 RPE 单层整合，也缺少血管供养。
- 正常 PRPF31 表达较高时对剪接和稳态的影响仍需评价。
来源与原文
- Modeling PRPF31 retinitis pigmentosa using retinal pigment epithelium and organoids combined with gene augmentation rescue原始研究 · NPJ Regenerative Medicine · 2022-08-16