脑类器官增殖与神经活动的联合评价
以 EdU 与标志染色评价细胞增殖和分化，并用钙成像、MEA 比较脑类器官处理前后的活动。
用途与模型
- 研究用途
- 研究化合物对人源神经发育及神经功能的影响。
- 模型与细胞来源
- 人多能干细胞来源脑类器官，主要示例以诱导多能干细胞（iPSC）构建；检测时间随发育阶段选择。
- 方法版本
- 原研究正式发表版本
- 实验形式
- EdU 荧光标记、Fluo-4 AM 活细胞钙成像及 6 孔 CytoView MEA。
材料与平台
- 模型与发育时间
- 培养前期以神经前体为主，神经元在约 30 天后出现，较成熟电生理特征通常在约 120 天观察；方法中依次使用 bFGF/EGF、BDNF/NT-3 及不额外补充这些生长因子的神经培养液。
- 增殖与分化检测
- 20 μM EdU 标记 2 小时，随后按研究问题选择追踪间隔，结合 DCX 等细胞类型标志；SOX2、Ki67、MAP2 及 GFAP 用于描述模型组成。
- 钙成像比较
- Fluo-4 AM 终浓度 2 μM；示例为 2 Hz 采样、3–5 分钟记录。比较基线和 100 μM 4-AP 处理 5 分钟后的信号。
- MEA 比较
- 6 孔 CytoView 板与 Maestro Edge 系统；基线记录 5–10 分钟，以 100 μM 4-AP 处理 5 分钟后继续记录。原图示例模型为第 160 天。
测量指标与分析
- EdU 与细胞类型标志共染
- 相对钙荧光变化及事件频率
- 电极放电与簇发放电频率
- 网络活动同步性
钙荧光按最低信号或刺激前基线归一化，分别比较事件频率、幅度与持续时间；MEA 按电极和区域比较放电、簇发放电及同步性。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 方法文章以 4-AP 处理前后记录演示神经活动变化，并展示 EdU 与神经元标志的共染。
- 测试范围
- 钙成像图 5 示例为第 120 天类器官，MEA 图 6 示例为第 160 天；4-AP 用于演示神经活动变化。
- 参照体系
- 同一记录体系中的刺激前基线与 4-AP 处理后条件。
- 研究结果
- 4-AP 处理后出现较强同步活动；EdU 与 DCX 共染用于观察神经分化。
适用条件与研究局限
- 钙信号与电极记录对应不同检测层级。
- 模型发育阶段、iPSC 细胞系和培养批次会影响结果。
- 钙染料洗脱和毒性限制跨多天重复测量。
- 成熟大模型可能因扩散受限形成中心坏死。
- 文中比较为 4-AP 刺激前后的神经活动变化。
来源与原文
- Evaluation of Neurotoxicity With Human Pluripotent Stem Cell–Derived Cerebral Organoids原始研究 · Current Protocols · 2023-04-17