CRX 患者视网膜类器官的 AAV 基因补充与表达评价
用患者及家族参照类器官，评价载体、启动子与正常 CRX 补充后的视蛋白表达。
用途与模型
- 研究用途
- 为显性 CRX 相关视网膜病比较基因递送条件及细胞表型改善。
- 模型与细胞来源
- I138fs48 和 K88N 两位 LCA 患者及各自健康父母参照的 iPSC 视网膜类器官。
- 方法版本
- 2021 年两种显性 CRX 变异的家族配对与长期培养版本
- 实验形式
- 96 孔板逐个培养的类器官，结合组织免疫染色、整体 RNA 及单细胞转录组。
材料与平台
- 载体与启动子
- 比较 AAV2／AAV8 报告转导；使用复合人 CRX 启动子驱动正常 CRX 的 AAV2 构建。
- I138fs48 给药条件
- 第 120 天加入每类器官 1×10¹¹或 3×10¹¹载体基因组；第 150、180 天评价，低剂量长期培养至第 300 天。
- 组织检测
- CRX、Recoverin、视紫红质、长／中波视锥视蛋白、Peripherin2 与 cleaved caspase-3 染色；每个类器官平均 3 个切面。
- 单细胞检测
- 第 200 天对健康、未处理与处理 I138fs48 模型做 10x 单细胞测序，Seurat 分群，比较视杆／视锥转录本。
测量指标与分析
- CRX 表达与报告转导比例
- 外节样结构及视蛋白染色
- cleaved caspase-3 空间分布
- 视杆与视锥的单细胞表达谱
患者与各自家族健康参照配对；组织信号按各类器官 3 切面平均，测序按细胞类型分析表达恢复，长短期培养分别记录。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 两种患者变异分别比较健康、未处理与 AAV-CRX 处理；I138fs48 另比较两种剂量并做长期培养和单细胞测序。
- 测试范围
- 2 位患者及各自健康家族参照；疾病表型验证 3 个分化批次。I138fs48 视紫红质定量健康 4 个类器官，未处理和各处理剂量 3 个；单细胞每组 2 个生物重复，健康每重复 4 个、患者各 3 个类器官，合计 40712 个细胞转录组。
- 参照体系
- 健康家族参照、患者未处理、AAV2／AAV8 及 CMV／CRX 启动子报告条件。
- 研究结果
- 两种变异模型的视紫红质及部分视锥视蛋白表达恢复；I138fs48 第 180 天视紫红质强度接近健康一半，两种剂量相近，第 300 天仍保留相关信号。
适用条件与研究局限
- 终点为组织与表达特征，不同变异的恢复程度有差别。
- 长期培养的类器官内部出现凋亡信号。
- 作者提出继续优化剂量、时间窗和视锥转导。
来源与原文
- Gene Therapy of Dominant CRX-Leber Congenital Amaurosis using Patient Stem Cell-Derived Retinal Organoids原始研究 · Stem Cell Reports · 2021-01-28