CEP290 反义寡核苷酸的视杯剪接与纤毛评价
对患者视杯使用 CEP290 morpholino，检测正确剪接比例、CEP290 和 RPGR 定位及纤毛形成。
用途与模型
- 研究用途
- 评价针对特定 CEP290 内含子变异的反义剪接纠正策略。
- 模型与细胞来源
- 1 名 CEP290 纯合变异男性患者的 2 个诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）克隆；相应成纤维细胞、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）与三维视杯，配合 BJ/LP6 对照背景。
- 方法版本
- 2016 年 c.2991+1665A>G 患者、2 克隆与 13 周视杯处理版本
- 实验形式
- 视杯起始每孔 9000 细胞、V 形 96 孔板，分化后悬浮培养；13 周开始每 3–4 天加 morpholino，持续 4 周。
材料与平台
- 视杯制备
- 起始 Y-27632 20 μM 与 IWR1e 3 μM；第 2 天补 2%Matrigel，第 12 天转非贴壁培养并加 SAG，第 15 天加入 CHIR99021，第 18 天转 NR 培养液；第 30 天分离神经上皮。
- 反义序列与递送
- CEP290-MO 为 25 nt，序列 GGATAGGTATGAGATACTCACAATT；标准对照 CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA。培养液含 EndoPorter 6 μM。
- 处理比较
- 视杯第 13 周开始 4 周处理，每 3–4 天加入；另在成纤维细胞测 10 μM 及以上 48 小时和 9 天剪接。RPE 每 7 天处理一次、共 14 天。
- 检测
- RT-PCR 比较 26-27 与含隐蔽外显子的 26-X-27 产物；CEP290 蛋白检测，Arl13/pericentrin 及 RPGR 纤毛定位成像。
测量指标与分析
- 正确剪接 CEP290 占总转录本比例
- CEP290 蛋白表达与纤毛定位
- 纤毛形成比例及长度
- RPGR 连接纤毛定位
用 RT-PCR 条带比较两类转录本；纤毛形成以基体与轴丝标志计数，测量长度；分别分析成纤维细胞、RPE 与视杯。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- CEP290-MO 与标准对照 MO、患者与正常背景比较，同时分析 3 类细胞体系。
- 测试范围
- 1 患者、2 克隆；Fig5 视杯纤毛为 5 次计数、每次至少 400 个 pericentrin 阳性结构。Fig7 为 3 重复、每条件至少 45 或 50 纤毛，依具体指标分开。
- 参照体系
- 标准 MO、正常背景及未处理/不同细胞类型条件。
- 研究结果
- 视杯正确剪接比例从 10%–20% 提高，克隆 1 超过 50%、克隆 2 最高 70%；纤毛数量/长度与 CEP290、RPGR 定位改善。RPE 纤毛形成比例增加未显著，长度增加显著。
适用条件与研究局限
- 模型来自 1 个患者，2 克隆为同一遗传背景。
- 各细胞类型的给药周期与纤毛计数不同。
- 干预从 13 周感光细胞前体阶段开始，主要检测剪接、纤毛和蛋白定位。
来源与原文
- Identification and Correction of Mechanisms Underlying Inherited Blindness in Human iPSC-Derived Optic Cups原始研究 · Cell Stem Cell · 2016-04-14