CasRx 单向与双向 RNA 靶向的患者神经元评价
分别在患者细胞中测重复 RNA 及蛋白，再用另一脊髓神经元流程比较谷氨酸损伤与剪接。
用途与模型
- 研究用途
- 评价 C9orf72 RNA 靶向构建体的靶向效率、短期反应和细胞保护。
- 模型与细胞来源
- 3 个患者背景的 NGN2 诱导皮层样神经元；脊髓神经元功能比较使用每类 6 个细胞系。
- 方法版本
- 2025 年 NGN2 皮层样靶向检测和脊髓神经元应激版本
- 实验形式
- NGN2 起始慢病毒转导并于第 5 天分选；脊髓神经元第 12 天核转染并观察 20 天。
材料与平台
- 单向与双向构建体
- CasRx 分别带正义链靶向 guide10、反义链靶向 guide17 或双引导阵列；与非靶向引导 RNA 比较。
- 皮层样路线
- NGN2 用 2 μg/mL 多西环素诱导；第 0 天加入慢病毒，第 5 天 FACS 收集 RNA/蛋白，PCR 以 GAPDH 归一化。
- 脊髓路线
- 第 12 天 500 万个神经元核转染 4 μg 质粒；培养 20 天后 10 μM 谷氨酸 4 小时，检测 PI 和 Alamar Blue。
测量指标与分析
- 两类重复 RNA 与 C9orf72 V2
- polyGP 和 polyGA
- 第 5 天细胞活力
- 转录组差异表达
- 谷氨酸后 PI 阳性核比例与 Alamar Blue 活力
- STMN2、HDGFL2 隐蔽外显子
靶向表达以 GAPDH 及非靶向条件归一化；PI 用每孔 10 视野平均，Alamar Blue 每条件 3 复孔。RNA-seq 每样本 2000 万序列并比较独立诱导。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 比较单向与双向 CasRx 及非靶向构建体；皮层样背景检验靶向，脊髓背景检验应激和剪接。
- 测试范围
- 皮层样 3 个患者细胞系，C9 line1 有 3 次诱导、另外 2 系各 1 次。RNA-seq 为 line1 的 3 次诱导。功能图每类 6 个细胞系。
- 参照体系
- 非靶向 guide、单向 guide10 或 17、双向阵列，以及对照神经元。
- 研究结果
- 皮层样正义 RNA 约降 40%，guide17 反义 RNA 约降 73%，V2 保留；正向处理 polyGP/polyGA 约降 60%。脊髓两类单向及双向均减轻谷氨酸损伤，guide17 和双向改善剪接。
适用条件与研究局限
- 两条人源路线的细胞类型、递送和时间不同。
- 反义链特异 DPR 未被现有免疫检测检出。
- 转录组无其他显著变化限当前深度和条件，作者提出进一步检查低水平脱靶。
来源与原文
- Dual-targeting CRISPR-CasRx reduces C9orf72 ALS/FTD sense and antisense repeat RNAs in vitro and in vivo原始研究 · Nature Communications · 2025-01-08