内质网应激条件下的 iPSC 运动神经元保护药物筛查
以两种内质网应激工具加速运动神经元损伤，结合高内涵细胞计数、神经突成像及磷酸化蛋白组筛选具有神经保护作用的候选药物。
用途与模型
- 研究用途
- 筛选神经保护化合物，并追踪应激相关损伤中的可干预环节。
- 模型与细胞来源
- 健康参照 1016A，TDP-43 G298S 与 SOD1 L144F 家族性 ALS 患者 iPSC；15 天分化形成混合神经细胞培养。
- 方法版本
- 2024 年健康、TDP-43 与 SOD1 背景应激及激酶候选验证版本
- 实验形式
- 96 孔存活与神经突成像；6 孔板分子及蛋白组样本。
材料与平台
- 标准存活实验
- 每孔 50000 个分化细胞，恢复 6 天；1 μM thapsigargin 或衣霉素与候选同时处理 48 小时。
- 参照化合物
- 0.1% DMSO 对照；kenpaullone 3 μM 和 MAP4K4 inhibitor 29 5 μM 作保护参照。
- 成像
- Hoechst、TUJ1 与 Isl1/2 染色；Operetta 或 ImageXpress，每孔 9–12 个视野，自动分析细胞核形态、细胞数量与神经突。
- 靶点线索
- 健康参照中 0.1 μM thapsigargin 处理 24/48 小时作蛋白与磷酸化蛋白组；JNK、PKC、BRAF 候选剂量—反应。
测量指标与分析
- 存活 Isl1/2+TUJ1+ 运动神经元数量
- 其他细胞存活
- 每个神经元的神经突结构
- UPR 与凋亡信号时间变化
- 蛋白及磷酸化位点变化
- 候选抑制剂的保护浓度—反应
完整核形态与神经元/运动神经元标志共同定义存活群体，细胞数以溶剂对照归一化。神经突指标按每神经元计算；磷酸化位点与激酶底物富集结果用于选择候选，再用存活实验检验。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 两种机制不同的应激工具；健康及两患者背景测试 kenpaullone/MAP4K4 抑制；健康参照中复验 JNK/PKC/BRAF 候选。
- 测试范围
- 3 株不同背景 iPSC。主要保护实验为 3 次生物学重复、每次 3 个技术重复；部分 JNK/PKC/BRAF 图为至少 3 次生物学重复。
- 参照体系
- 溶剂、单独应激、已知保护化合物，以及健康模型中利鲁唑/依达拉奉。
- 研究结果
- 应激优先损伤运动神经元，kenpaullone 与 MAP4K4 抑制在 3 种细胞背景中保护存活及神经突。JNK/PKC/BRAF 候选在健康参照的两种应激条件下也有保护作用。
适用条件与研究局限
- 采用药理应激加速损伤；当前人源背景仅两种家族性 ALS 变异和一个健康参照。
- 遗传背景未作同背景配对，患者间差异可能含多种遗传因素。
- 不同候选的保护作用已测，但具体作用机制仍需进一步研究。
来源与原文
- Analyzing the ER stress response in ALS patient derived motor neurons identifies druggable neuroprotective targets原始研究 · Frontiers in Cellular Neuroscience · 2024-01-19