患者运动神经元的钾通道阻断药物比较
在患者运动神经元中比较 Apamin 与 XE991，测神经突、聚集物、RNA 聚集灶、CREB 与突触接触。
用途与模型
- 研究用途
- 评价神经元活动调节候选药物对肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）运动神经元细胞状态及突触指标的影响。
- 模型与细胞来源
- 3 名 C9orf72 患者背景；2 个健康对照和 1 个纠正同遗传背景；另有 1 个 TBK1 患者背景。
- 方法版本
- 2021 年 C9orf72 主要队列及 TBK1 补充背景、DIV63–70 处理版本
- 实验形式
- 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）分化运动神经元混合培养，在培养第 63–70 天处理；相关数据按细胞系与独立分化/处理分别分析。
材料与平台
- 细胞培养
- Matrigel 包被培养器；iPSC 在 mTeSR1 中培养，胚样体诱导后解离并分化运动神经元。
- 人源药物比较
- DIV63 开始 Apamin 或 XE991 处理，至 DIV70 结束，每 2 天更换一半培养液，设溶剂对照。
- 初筛条件
- 原代大鼠皮层神经元表达 poly(GA) 聚集蛋白，处理 7 天；Apamin 500 nM、XE991 10 μM 减少聚集物信号，100 μM XE991 降低存活。
- 成像与表达
- ImageJ SNT 测神经突；Imaris 比较突触前/后标志共定位；FISH 测 RNA 聚集灶，并做 CREB 磷酸化、qPCR、RNAseq 与蛋白组。
测量指标与分析
- 神经突长度
- 活化 caspase-3 阳性运动神经元
- p62 聚集面积和聚集负荷
- RNA 聚集灶
- CREB S133 磷酸化
- Homer1b/c 与突触前标志共定位
- 转录组与蛋白组
神经突用 ImageJ 的 SNT 插件半自动分析；聚集面积除以神经元胞体面积。突触成像方法将两标志点中心的最小间距写为 0.8 μm，同时要求标志点距树突不超过 1 μm。3 个细胞系的实验先按细胞系平均，再比较组别；药物分析采用盲法。
研究设计与结果
盲法比较研究
- 研究设计
- 对 Apamin、XE991 及溶剂处理进行盲法分析，配合患者/对照、培养时间及 TBK1 补充背景。
- 测试范围
- C9orf72 主要成像 3 患者细胞系，各 3 次独立处理；部分聚集分析 1 细胞系。RNAseq 为 2 患者细胞系；蛋白组每组 4 生物重复、每样本 3 技术重复。
- 参照体系
- 溶剂对照、2 健康背景与 1 纠正背景；原代筛选及 1 个 TBK1 背景分别比较。
- 研究结果
- 两药增加神经突长度、减少部分聚集/凋亡指标，并提高 CREB 磷酸化及突触数量。患者突触仍低于健康；TBK1 Apamin 聚集物缩小未显著，P=0.07。
适用条件与研究局限
- 不同检测使用的患者细胞系数和重复层级不同。
- 原代筛选中，10 Hz 光刺激增加聚集负荷，100 μM XE991 降低神经元存活。
- 体系为混合神经元培养；突触指标部分恢复至接近健康但仍较低。
来源与原文
- Synaptic disruption and CREB‐regulated transcription are restored by K+ channel blockers in ALS原始研究 · EMBO Molecular Medicine · 2021-06-14