用驻留时间分布解析灌流细胞实验的暴露时程

动态暴露需要分别描述输入、细胞和出口

2022 年 7 月 20 日，Journal of Visualized Experiments（JoVE）发表了罗格斯大学（Rutgers University）团队的一份动态灌流方法论文。团队在 2021 年前期研究的基础上，展示多路培养、短时刺激和连续分段采样的组合，用于观察分钟至小时尺度的细胞分泌变化。

静态培养往往依赖人工更换培养液和取样，通过换液移除刺激物时，其他培养液成分及已积累分泌物也随之改变。连续灌流和自动采样的设计，目的在于减少这些同步扰动，并提高分泌变化的时间分辨率。

在这类实验中，入口加入的浓度波形经过管路输送，才到达培养细胞；细胞释放的物质还要经过下游流路，才能进入样本。分子在流动中发生分散，同一段输入会被延迟和展宽，影响刺激时程与细胞反应的对应关系。

论文把动态输入与采样分成可以表征的环节：上游控制溶质输入，细胞在孔板内培养，下游按时间收集流出的培养液。基础配置可同时处理最多 6 路培养，并可通过增加输入来源形成短脉冲或近似药代动力学的时程。

示踪实验量化管路造成的信号展宽

作者用可检测的示踪物测量流体通过系统的时间分布，得到驻留时间分布（residence time distribution，RTD）。这项测量描述一次输入如何在后续时间内陆续流出，为解释浓度波形在装置中的变化提供依据。

代表性实验分别表征单段入口管路和包含入口管路、培养孔板与出口管路的完整系统。两组示踪数据均用轴向分散模型拟合，平均驻留时间分别为 317.2 分钟和 596.5 分钟。这些数值对应各自流路配置。

拟合结果还受参数初值影响。论文展示了一组偏离实际时间尺度的初值所产生的较差拟合，以及调整初值后得到的拟合曲线。作者依据体系体积与流量估计平均驻留时间，为拟合选择了更接近实际的初值。

由实测 RTD 估计细胞所遇到的刺激

得到 RTD 后，团队将输入波形与相应分布进行信号卷积，分别估计刺激到达培养孔板和系统出口时的浓度变化。培养孔板入口使用上游管路的 RTD，样本出口则使用完整系统的 RTD。

细胞示例采用一次持续 1.5 小时的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）输入。计算结果显示，入口的矩形脉冲经过输送后变成较宽的波形，细胞实际受到刺激的时间段因此需要结合传输过程解释。

这部分浓度曲线来自示踪数据和模型预测；细胞分泌反应则由后续样本独立测量。两类信息放在同一时间轴上，可以区分刺激传输和细胞响应各自贡献的时差。

四路培养记录了短时刺激后的分泌变化

团队采用 HEK293 人源细胞，检测核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）响应元件驱动的分泌型 Gaussia 荧光素酶（Gaussia luciferase，GLuc）信号。4 路培养中，2 路接受 TNF-α短时刺激，另 2 路作为未刺激对照；流出样本持续收集约 40 小时。

每份样本的发光值按该份样本对应的收集时长换算为每小时读数。团队再用下游管路的平均驻留时间校正采样时间，将结果与预测的刺激曲线对照。受刺激的培养中，GLuc 分泌在 TNF-α 首次到达后约 9 小时达到峰值，随后逐渐下降。

未刺激的两路保持较低的分泌水平，并随观察时间缓慢增加；作者认为这可能反映细胞群体增长。所有曲线最初两份样本之间均出现下降，论文将其归于灌流开始前已积累的 GLuc 进入首份样本。

出口分泌信号仍受流路分散影响

论文指出，细胞释放的物质经过下游管路后，分泌信号仍会被展宽。反卷积在理论上可去除这一影响，但真实数据中的噪声会被放大，使实际应用更困难。对变化持续数小时至数十小时的过程，管路效应主要表现为时间平移，波形改变可能较小。

RTD 也与具体装置条件有关。论文讨论了示踪物、溶液背景、输入脉冲及流路配置对表征的影响，并将这些因素作为解释动态数据时的组成部分。示踪表征与生物学测量分别进行，有助于判断观察到的迟缓变化来自流路还是细胞。

作者将按药代时程研究细胞药物反应、考察昼夜节律对药物响应的影响，以及把化疗暴露曲线用于个体化肿瘤样本列为后续应用方向。这份方法论文的具体贡献，是提供了动态输入、传输表征与分时读数相互核对的实验依据。