用患者血清测试促进 IGF-I 释放的候选蛋白
2018 年 5 月，辛辛那提儿童医院医学中心（Cincinnati Children’s Hospital Medical Center）团队在 Journal of the Endocrine Society 发表研究，把重组人妊娠相关血浆蛋白 A2（recombinant human pregnancy-associated plasma protein A2，rhPAPPA2）加入患者血清，观察它能否提高游离胰岛素样生长因子 I（insulin-like growth factor I，IGF-I）的水平。
血清中的 IGF-I 大多与结合蛋白形成复合物，游离部分只占少数。PAPPA2 是一种蛋白酶，可以切割 IGF 结合蛋白 3（IGF-binding protein 3，IGFBP-3）和 IGFBP-5，使 IGF-I 从结合状态释放出来。因此，研究同时测量完整 IGFBP-3 和游离 IGF-I，追踪候选蛋白对这一步生化过程的影响。
这一研究问题来自一种罕见遗传病：PAPPA2 功能缺陷患者的总 IGF-I 水平可以升高，但游离 IGF-I 仍然偏低，并伴随生长迟缓。研究者希望补充有活性的 PAPPA2，使血清中已经存在的结合态 IGF-I 释放为游离形式。
7 位受试者提供两种生化背景
本次体外实验使用 3 名 PAPPA2 缺陷患者的血清。他们是一家中的 3 名同胞，均携带纯合 p.Ala1033Val 变异。此前功能研究显示，这一变异产生的 PAPPA2 缺乏蛋白水解活性。另一个比较组来自 4 名特发性矮小（idiopathic short stature，ISS）男性患者，他们并无 PAPPA2 缺陷。
两组的起点并不相同。与 PAPPA2 缺陷组相比，ISS 组的总 IGF-I、总 IGFBP-3 和完整 IGFBP-3 较低，游离 IGF-I 及其占总 IGF-I 的比例则较高。这些差别使研究能够比较：当血清中可释放的结合态 IGF-I 储备不同时，同一候选蛋白会产生怎样的反应。
血清实验保留了各位受试者的 IGF-I 与结合蛋白背景，又允许研究者单独改变加入的 rhPAPPA2。与只用纯化底物检查酶活性相比，这一步把候选作用放到了患者来源的复杂生化环境中。
先核实酶活性，再比较 4 小时内的血清变化
团队先检查所制备 rhPAPPA2 的功能：它能使成纤维细胞培养液中的完整 IGFBP-3 减少，也能切割重组 IGFBP-5。免疫印迹显示，加入与未加入 rhPAPPA2 的条件产生了不同的蛋白条带，支持后续使用这批蛋白开展血清实验。
随后，研究在两组血清中设置未加酶和两档 rhPAPPA2 条件，在 4 小时内多次测量完整 IGFBP-3 及游离 IGF-I。两项指标均采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）；前者反映底物是否保持完整，后者反映可游离的 IGF-I 数量。
未加 rhPAPPA2 时，PAPPA2 缺陷组的两项指标在 4 小时内保持稳定。完整 IGFBP-3 与游离 IGF-I 的前后比较，P 值分别为 0.42 和 0.57。加入 rhPAPPA2 后，完整 IGFBP-3 下降，同时游离 IGF-I 升高；较高添加量带来了更明显的变化。
ISS 组也出现了相同方向的变化，但游离 IGF-I 增幅较小。作者概括，缺陷组的游离 IGF-I 升至原水平的 15–100 倍，ISS 组为 1.7–5 倍。组间统计比较显示，两档添加条件下缺陷组的增幅均更高，对应 P 值为 0.0005 和 0.01。作者认为，这与缺陷组原本积累了更多结合态 IGF-I 相符。
测量起点与重复比较会影响结果解释
论文图 3 注明，标为“0 分钟”的样品在进入相应检测时已经经历了孵育，因此酶可能已经发生作用。同一份血清在不同 rhPAPPA2 添加量下，起始读数也会不同。
统计分析采用线性混合模型，处理同一份样品的重复测量和一个缺失数据点，并考察时间、添加量及组别的影响。研究定位为概念验证，未作多重比较校正；参与者总数为 3 名缺陷患者和 4 名 ISS 患者。
作者还注意到，ISS 组中起始游离 IGF-I 占比最高的一份血清，加入 PAPPA2 后升幅最小。他们提出，该样品可进一步释放的结合态 IGF-I 可能较少。
单例血浆观察与体外重组蛋白实验各有结果
论文另报告了 1 名成年 PAPPA2 缺陷患者接受血浆后 2 周的生化变化。其游离 IGF-I 在第 1 天升至基线约 2.5 倍，随后逐渐回到基线；血清 PAPPA2 未出现可测得的显著升高，总 IGF-I、总 IGFBP-3 和完整 IGFBP-3 也无显著变化。
由于完整 IGFBP-3 未下降，作者无法据此确认临床观察中的游离 IGF-I 升高是否由其切割引起；另一种底物 IGFBP-5 在该观察中没有测量。相比之下，体外实验同时观察到完整 IGFBP-3 减少与游离 IGF-I 增加，支持 rhPAPPA2 在患者血清中调节 IGF-I 可利用性的候选机制。
研究结束时，PAPPA2 的药代动力学和药效学资料仍然缺乏，儿童 PAPPA2 与游离 IGF-I 的正常范围也有待建立。体外结果为这一治疗候选提供了患者样本中的生化依据，其能否持续促进生长仍需后续研究。