两项测定分别观察活化信号和细胞分裂影响
经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）的 444A 测试指南，于 2025 年 6 月 25 日通过。当前文件标注 2026 年 7 月 2 日对第 35 段第二句作过更正。它介绍 IL-2 Luc 与 IL-2 Luc LTT 两项体外测定的组合，用于识别可能具有免疫抑制作用的物质。其中，IL-2 指白细胞介素-2（interleukin-2），LTT 是白细胞毒性试验（leukocyte toxicity test）的缩写；两项方法均使用荧光素酶报告体系。
两项测定使用同一个人源模型：由 Jurkat T 淋巴细胞系建立的 2H4 报告细胞。IL-2 Luc 关注物质对 IL-2 产生相关信号、即 T 细胞活化的影响；IL-2 Luc LTT 则关注抗有丝分裂作用，提供细胞增殖受抑及相关骨髓毒性的信息。两项结果分别分析后再组合判断。
评价资料包括药物，也包括其他化学品
指南介绍的一组扩展评价包含 83 种受试物，其中 46 种是药物、37 种是非药物化学品。药物部分包括 12 种抗癌药、8 种具有抗有丝分裂作用的免疫抑制药、8 种不具有此类作用的免疫抑制药、3 种 Janus 激酶（Janus kinase，JAK）抑制剂，以及 15 种非免疫抑制药。
这个组成说明该方法与药物免疫安全有直接关联，也提供了不同作用机制下的比较。不过，文件给出的总体分类结果结合了药物和其他化学品，并未单独报告这 46 种药物对临床风险的预测性能。不同作用机制和适用条件，需要与整体性能一起阅读。
重复性与分类性能采用不同参照
验证由日本替代方法验证中心（Japanese Center for the Validation of Alternative Methods，JaCVAM）协调，参与者包括牵头实验室和 3 家独立实验室。指南报告，IL-2 Luc 的实验室内重复性为 80.0%（4/5），实验室间重复性为 80.0%（16/20）；这些比例用于评价重复分类的一致性。
IL-2 Luc LTT 的平均实验室内重复性为 100.0%（15/15），实验室间为 92.0%（23/25）。在指南所述另一组参考分类评价中，该测定的平均敏感性为 71.4%（15/21）、特异性为 100.0%（4/4）。重复性和对参考类别的识别能力，分别采用不同问题与分母。
在扩展受试物资料中，单独使用一种测定仍可能漏检部分免疫抑制机制。文件因此支持将两项测定组合，并与其他试验共同用于免疫毒性评价。
组合提高检出率，同时保留误判问题
组合判定把任一测定提示免疫抑制的物质归为体外免疫抑制阳性。指南报告的组合结果为敏感性 88.7%（47/53）、特异性 53.8%（14/26），总体正确分类比例 77.2%（61/79）。在考虑适用范围后的另一组结果中，敏感性为 90.0%（45/50），特异性仍为 53.8%（14/26），总体正确分类比例 77.6%（59/76）。
这些结果显示，两项测定互补后能够检出更多参考类别中的免疫抑制物质，同时特异性仍有限。指南据此提出，这两项测定仍需与其他试验一起用于免疫毒性评价。两组组合结果分别对应 79 种与 76 种受试物的评价集合。
信号通路、代谢能力和发光干扰限定适用范围
试验采用的刺激方式绕过 T 细胞受体激活后的部分早期信号，因此对作用于这些环节的物质可能缺少检测能力。Jurkat 来源细胞与正常 T 细胞也存在差异，模型本身没有用于活化受试物的充分代谢能力。需要代谢活化才发挥作用的物质，属于指南列出的适用范围外情形。
高疏水性物质和对荧光素酶反应的干扰也会影响测量。发光信号的变化既可能来自关注的生物过程，也可能来自受试物直接干扰检测体系，因此需结合适用范围和其他证据解释。两种功能信息的互补，是这项人源体外方法的主要价值；完整免疫安全判断仍涉及更多细胞与作用机制。文件还列出检出能力的限制：只在较高受试物水平才出现的免疫抑制作用，可能无法由这两项测定识别。