用药理阻断观察视网膜发育

中山大学中山眼科中心团队以 H9 人胚胎干细胞建立视网膜类器官,用 CXCR4 拮抗剂 AMD3100 观察细胞分化和空间分布变化。研究将类器官结果与斑马鱼视网膜比较,关注同一药理干预在体外与体内发育模型中的对应程度。

常规分化的类器官包含神经节细胞、无长突细胞和光感受器前体等标志,并逐步形成层次结构。研究在分化第 6–10 周比较药物与 PBS 对照,采用细胞标志、类器官数量与直径、神经突长度和细胞定位等多种指标。

类器官数量、直径和分化标志呈现不同变化

AMD3100 处理后,类器官形成数量降至对照的约 0.608 倍,直径则增大。第 10 周平均直径由对照的约 303 μm 增至约 396 μm。两项指标反映的现象不同:形成的结构较少,但留下的结构平均更大。

MCM2 增殖相关标志的相对面积未出现显著组间变化,神经元标志 TUJ1 的相对面积则在后期降低。方法以标志与核染色 DAPI 的重叠面积进行定量,因此这些比例主要反映切片的染色面积比较。

部分神经细胞标志的阳性面积比例降低,层次分布改变

第 8–10 周,早期神经节细胞标志 HuD 阳性面积与 DAPI 标记面积的比值降低,同时更多阳性染色出现在内神经母细胞层的外围区域。成熟神经节细胞标志 BRN3 的结果呈相似方向。无长突细胞标志 AP-2α 也显示比例和分布变化。

光感受器前体的结果随标志而不同。OTX2 阳性面积比例在第 8–10 周未显著变化,但阳性细胞在类器官内部出现异常聚集;较晚期标志 RECOVERIN 在第 10 周的阳性面积比例下降。神经突成像同时显示长度减少和生长方向异常。

AMD3100 处理与 PBS 对照的神经节细胞标志 HuD 染色及定位比较。

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AMD3100 处理与 PBS 对照的神经节细胞标志 HuD 染色及定位比较。(Yihui Wu et al. / International Journal of Molecular Sciences, 2022, 图 5;CC BY 4.0;PMC)

动物比较揭示相似结果和模型差异

斑马鱼视网膜中的神经节细胞、无长突细胞及光感受器相关标志也随 AMD3100 处理减少,并出现神经突分布异常。不过,类器官内观察到的光感受器前体异常聚集没有在斑马鱼视网膜中出现。

作者将这一差别与模型周围结构联系起来:体内视网膜具有色素上皮及血管、免疫等微环境,类器官结构较简化。论文还指出,比较只覆盖所选择的发育阶段,AMD3100 的潜在其他作用靶点和细胞定位变化机制仍待进一步研究。

原文记载的药物处理时间存在差异

实验方法记录 AMD3100 浓度为 2 μg/mL,并在分化第 10 天加入;结果章节则写在第 3 天加入。两处时间记载不同。

来源与延伸阅读

  1. Comparison of the Response to the CXCR4 Antagonist AMD3100 during the Development of Retinal Organoids Derived from ES Cells and Zebrafish Retina. International Journal of Molecular Sciences (2022). ↗