区分患者差异与技术变异
肿瘤异质性既存在于不同患者之间，也存在于同一个肿瘤的不同区域和时间点。2021 年发表于 Nature Materials 的综述 Next-generation cancer organoids，讨论怎样用患者来源类器官研究这些差异，并减少培养过程额外带来的技术变异。
不同肿瘤细胞可具有不同遗传、表达和代谢状态，周围成纤维细胞、免疫细胞及细胞外基质也会影响它们的行为。药物响应因此可能同时受到肿瘤细胞自身和局部环境影响。
作者强调，减少技术变异之后，仍需确认模型保留了原肿瘤的生物学差异。标准化使供者与肿瘤区域之间的实际差异能够被可靠比较。
取材与建模决定哪些细胞进入模型
少量活检或单一区域组织未必包含整个肿瘤的细胞状态。综述介绍多区域取材、原发灶与转移灶配对的研究，发现同一患者不同位置形成的类器官可保留不同分子特征和药物反应。
模型建立的成功率还受癌种、病理状态、既往治疗及复发情况影响。若某些患者材料更容易形成模型，样本库可能过度代表这些群体，未进入样本库的人群则在后续药物比较中被遗漏。
正常细胞混入也是一个实际问题。综述介绍的肺癌模型检查发现，部分培养物被生长较快的正常气道细胞占据。其中一项涉及 59 名患者的研究发现，58% 的类器官培养物出现正常气道细胞过度生长。
微孔阵列、较均一的组织片及自动成像为控制起始材料提供了工具。其中一项结直肠癌类器官工作比较 80 种相关药物，说明统一材料尺度可以服务于较大规模功能研究。
在一项乳腺癌研究中，冷冻保存 6–12 个月的组织仍可用于建立类器官，药物响应与同一组织取材时建立的新鲜类器官相近。这为难以及时开展培养的样本提供了保存途径。
培养环境影响细胞选择与共培养
培养环境支持哪些细胞，会决定模型最终保留什么。患者肿瘤对生长因子的依赖可随基因和细胞状态不同而改变，对健康组织有效的培养条件，不一定适合所有肿瘤来源的模型。
条件培养液可降低部分培养材料的成本，但也包含目标成分以外的复杂物质；动物来源血清的组成同样复杂。不同批次的活性和组成变化，可能改变类器官生长及药物响应。
血清还可能随条件培养液间接进入类器官培养体系。综述提到，在一项胰腺模型研究中，含胎牛血清的条件培养液不利于配对正常胰腺类器官的长期培养。
当研究免疫治疗或基质影响时，肿瘤细胞之外的成分具有具体作用。综述介绍保留原生免疫与成纤维细胞的模型，也讨论外源共培养：细胞类型、状态及来源都会影响所观察到的药物过程。
胰腺癌类器官共培养研究识别出肌成纤维样和炎症性两类成纤维细胞，它们与肿瘤细胞的相互作用不同。在食管腺癌模型中，患者来源成纤维细胞分泌的 IL-6 促进上皮间质转化和耐药；相应小鼠成纤维细胞未产生同样的效应。
细胞外基质参与药物响应
细胞外基质（extracellular matrix，ECM）不仅提供三维支撑，其组成、硬度、孔隙、降解及信号呈递也影响细胞状态。肿瘤中的基质变化可能同时影响肿瘤细胞和周围细胞，因此需要与药物反应共同观察。
常见动物来源基质支持许多类器官建立，但成分和批次差异较大，也较难单独控制力学与生物化学特征。综述将这些问题与重复性和自动化研究联系起来。
在一项胶质母细胞瘤类器官研究中，研究者比较了硬度相近、透明质酸含量不同的材料。降低透明质酸含量后，药物敏感性约提高 3 倍；抑制其受体 CD44 也消除了高透明质酸环境中的耐药表型。
成分可控的人工基质让研究者分别改变黏附信号、材料硬度或降解特征，从而分析哪些因素影响类器官表型。不过，综述指出，部分人工基质的培养效率仍低于常用动物来源基质，为某一组织设计的平台也往往不能直接用于其他组织。
此外，一些研究先在动物来源基质中建立类器官，再转入人工材料。前期培养已经可能选择出特定细胞群，因而作者提出，应进一步研究从患者样本开始直接建立人工基质模型，并验证其后续扩增、表型和药物响应。动态改变基质性质与实时监测细胞造成的材料变化，也是综述提出的发展方向。
细胞监测与血管化模型的进展
细胞条形码和机器学习图像分析可用于追踪类器官扩增过程，观察不同细胞群如何变化。综述将这些方法与微加工技术结合起来讨论，以研究起始材料对类器官形成和细胞选择的影响。
微流控平台已被用于研究肿瘤与血管网络的相互作用，包括肿瘤细胞穿出血管、药物递送和肿瘤生长。作者提出，进一步整合血管及其他微环境细胞，有望使类器官模型更好地反映患者肿瘤的组织结构。