RPGR 同遗传背景类器官的结构与电生理比较
先纠正患者 iPSC，再分化视网膜类器官，分阶段比较感光细胞、连接纤毛和膜片钳电流。
用途与模型
- 研究用途
- 比较 RPGR 变异纠正前后的患者来源视网膜模型，评价感光细胞结构及功能变化。
- 模型与细胞来源
- RPGR 患者 1 的 c.1685_1686delAT 变异背景、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）纠正克隆与健康对照；建系总范围为 3 名患者及 3 名健康供者。
- 方法版本
- 2018 年患者 1 iPSC 基因纠正与视网膜类器官验证版本
- 实验形式
- 悬浮三维视网膜分化；22 周结构和表达比较，36 周类器官外层细胞膜片钳。
材料与平台
- 基因纠正
- pX330 携带 sgRNA；正常对照 DNA 构建 3.4 kb 同源模板及新霉素筛选盒。两载体经 LONZA 4D 电转，G418 筛选，PCR 和测序确认。
- 视网膜分化
- 悬浮培养按时加入 BMP4，形成类器官并长期培养；用健康、患者与纠正背景分别比较。
- 电流记录
- 24 或 36 周类器官置记录室，用 95% O2/5% CO2 平衡 Ames 液灌流；外层小细胞全细胞膜片钳，电极 4–7 MΩ，Alexa Fluor 555 50 μM 标记；1 kHz 滤波、20 kHz 采样。
- 结构与表达
- Recoverin 及视蛋白染色、Arl13b/GT335 纤毛标志、HCN-1 染色和分期 RNA 测序；ZD7288 用于验证 HCN 相关电流。
测量指标与分析
- 感光细胞数量及形态
- 连接纤毛长度
- 感光细胞相关表达
- 超极化激活电流 Ih
- HCN-1 表达和定位
- TUNEL 及 caspase-3
按培养时间和细胞背景分别比较结构与表达；膜片钳生成电流—电压关系并检验 HCN 阻断响应。纤毛与细胞数量按对应图的类器官/细胞层级分析。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 患者、健康与同背景纠正类器官比较，配合 HCN 阻断、纤毛和基因表达检测。
- 测试范围
- 患者 1 纠正实验确认 2 克隆；36 周电流图健康 24 细胞、患者 21、纠正 15，3 次独立实验；主要结构图每类 3 类器官。
- 参照体系
- 未纠正患者 1、健康对照及纠正背景；ZD7288 处理为电流参照。
- 研究结果
- 纠正后感光细胞数量和形态改善；连接纤毛长度由患者 1.700 μm 改善至 2.125 μm，对照 2.112 μm。Ih 及 HCN-1 表达改善；caspase-3 未明显改变。
适用条件与研究局限
- 核心纠正比较限患者 1 遗传背景，不同检测的供者、细胞或类器官数不同。
- 结构、转录与电流在不同培养阶段检测。
- 检测终点为体外细胞表型、电流及表达；细胞减少的具体机制仍为研究线索。
来源与原文
- Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients原始研究 · Stem Cell Reports · 2018-03-08