视网膜类器官的 AAV 衣壳、启动子与报告转导比较
用荧光报告、细胞标志共染和 ATP 检测，比较 AAV 构建在视网膜类器官中的表达比例、位置及活力影响。
用途与模型
- 研究用途
- 为后续视网膜基因递送选取衣壳、启动子和剂量组合。
- 模型与细胞来源
- 健康来源 WT3 iPSC（SB-AD4）分化的视网膜类器官，来自同一分化批次。
- 方法版本
- 2022 年 WT3 单株、同批次类器官的多构建比较版本
- 实验形式
- U 形底 96 孔板逐个培养；第 150 天给药，27 天后做 10µm 切片及 ATP 检测。
材料与平台
- 报告构建
- CAG-GFP/RFP、GRK1-GFP 及 EFS-GFP；测试 AAV5、AAV2 7m8、含 4 个突变位点的 AAV2、AAV2 Y444F、AAV8 Y733F，非完整交叉矩阵。
- 给药与换液
- 每类器官通常加入 1×10¹⁰载体基因组、体积 50µl；GRK1-AAV8 Y733F 有效比较使用 5×10¹⁰。每 3–4 天换 50% 培养液，不再次补载体。
- 细胞定位
- Recoverin、视紫红质、L/M 视锥视蛋白、PKCα及 GFAP 共染；共聚焦 10µm Z-stack 最大投影，ImageJ 分析报告阳性与共定位。
- ATP 活力
- CellTiter-Glo 3D，室温振荡 30 分钟；培养液空白扣除后用 ATP 标准曲线测量，并相对 4 个未处理类器官均值计算。
测量指标与分析
- 报告阳性细胞占比
- 感光细胞及其他细胞标志共定位
- 报告表达出现时间
- ATP 信号与类器官面积
按具体载体组合比较切片中的报告比例和细胞位置；ATP 组间比较与类器官大小相关分析分别开展。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 同批次第 150 天类器官比较衣壳、启动子和剂量；连续成像后在 27 天做组织定位与活力检测。
- 测试范围
- 1 株 WT3 iPSC。报告定量每组至少 3 个类器官、27–35 幅图像；ATP 每处理组 4 个类器官，未处理参照 4 个。给药类器官数依构建为 3–14 个。
- 参照体系
- 不同衣壳及 CAG、GRK1、EFS 报告构建；未处理类器官用于 ATP 参照。
- 研究结果
- CAG 条件含 4 个突变位点的 AAV2 和 7m8 平均报告比例 19.4% 与 16.4%，二者无显著差异。GRK1 使信号集中外层；AAV8 Y733F 在较高剂量下约 4.7%，两种 AAV2 构建约 5%。所有检测处理组 ATP 与未处理无显著差异。
适用条件与研究局限
- GRK1-AAV8 Y733F 使用较高剂量，各组合不是全因素同剂量比较。
- 类器官的大小和细胞组成影响转导与 ATP 信号。
- 部分构建的报告基因及 WPRE 元件不同，结果按具体构建解释。
来源与原文
- Tropism of AAV Vectors in Photoreceptor-Like Cells of Human iPSC-Derived Retinal Organoids原始研究 · Translational Vision Science & Technology · 2022-04-04