近端小管增多的肾类器官转运与顺铂损伤检测
延长肾祖细胞单层分化后形成类器官，以白蛋白和有机阳离子探针检查转运，再比较顺铂引起的 KIM-1 变化。
用途与模型
- 研究用途
- 研究类器官近端小管组成、底物转运与顺铂损伤反应的关系。
- 模型与细胞来源
- 人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）来源肾类器官；同细胞系的标准 7+14 天方案与近端小管增强 13+14 天方案比较。
- 方法版本
- 2022 年 13+14 天分化培养方案
- 实验形式
- 先单层分化，再以每 25 万个细胞形成聚集体，在 Transwell 膜上培养 14 天。
材料与平台
- 分化培养
- 人 iPSC、分化后期采用肾单位祖细胞维持培养基（CDBLY2）；BMP7 为 10 ng/mL，标准组合中为 5 ng/mL；三维阶段使用 FGF9 和肝素等添加物。
- 底物及抑制剂
- TRITC 标记白蛋白；DAPI 有机阳离子探针，西咪替丁 100 μM 预处理 15 分钟；DRAQ7 检查死细胞。
- 药物损伤
- 顺铂 20 μM 暴露 24 小时，另设相同体积 PBS 对照。
- 检测与细胞组成
- KIM-1/LTL 免疫染色、HAVCR1 定量 PCR、HNF4A 报告及表达；同时考察近端小管所占比例。
测量指标与分析
- 荧光白蛋白摄取
- DAPI 摄取及西咪替丁抑制反应
- 近端小管 KIM-1 蛋白
- HAVCR1 表达及按 HNF4A 校正的结果
在同细胞系与相同三维培养日龄下比较两种分化方案。HAVCR1 先按 GAPDH 归一化，再用 HNF4A 表达考虑近端小管比例；分别保留整体表达与比例校正后的比较。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 两种分化方案的底物摄取和抑制剂比较，随后进行顺铂与 PBS 对照实验。
- 测试范围
- 顺铂损伤基因分析为 3 次独立实验中的 8 个对照与 9 个处理培养重复。
- 参照体系
- 标准方案类器官、PBS 未加药条件，以及有无西咪替丁的探针摄取。
- 研究结果
- 增强方案表现出较广的白蛋白摄取及可被西咪替丁抑制的 DAPI 摄取；顺铂后 KIM-1 增加。HAVCR1 整体反应较高，但按 HNF4A 校正后两方案无显著差异。
适用条件与研究局限
- 增强方案仍包含大量早期近端小管细胞，成熟细胞比例有限。
- 药物损伤比较集中在顺铂；整体检测受小管比例影响。
来源与原文
- Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.原始研究 · Nature Communications · 2022-10-08