多细胞肝球状体的转运蛋白与胆汁排出功能表征
将转运蛋白绝对定量、位置成像、胆汁酸分布与多药耐药相关蛋白 2（MRP2）的荧光排出测量结合，比较球状体与同供者肝细胞参照。
用途与模型
- 研究用途
- 评价长期肝培养是否适合特定药物运输问题，识别定量胆汁排出测量受到的结构限制。
- 模型与细胞来源
- 每球约 1,200 个人细胞，75% 原代肝细胞、10% Kupffer 巨噬细胞、10% 肝星状和 5% 肝窦内皮细胞；原代肝细胞为 3 位供者。
- 方法版本
- 2025 年 3 位肝细胞供者、13 种转运蛋白及 21 天培养版本
- 实验形式
- 低吸附孔板培养 21 天，第 7/14/21 天采样；同供者新鲜复苏和第 5 天夹心培养作参照。
材料与平台
- 定量蛋白
- 约 128 个球状体合样，13 种转运蛋白靶向质谱，每条件 3 个技术重复；定量下限 0.1 pmol/mg 膜蛋白。
- 调控与位置
- 鹅去氧胆酸 20 μM，第 6–14 天随换液加入；转录组与定量 PCR，整球和切片免疫染色。
- 排出功能
- 5 μM 羧基二氯荧光素二乙酸酯（CDFDA）处理 30 分钟，进入细胞后经酯酶转为羧基二氯荧光素（CDF）；含钙与无钙缓冲液下观察荧光腔室和释放，配合细胞及胆汁腔室合样与培养液的胆汁酸质谱。
测量指标与分析
- 13 种转运蛋白绝对含量
- 转运体膜上及球内位置
- 胆汁酸的细胞加胆汁与培养液分布
- CDF 胆小管样腔室积聚
- 无钙处理后荧光释放和滞留
按肝细胞供者与培养形式比较蛋白及胆汁酸，将具体功能试验与定位结果结合，并评价无钙处理对胆汁排出定量的影响。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 3 位供者球状体在 7/14/21 天与同供者新鲜复苏及第 5 天夹心培养比较；增加调控和荧光功能试验。
- 测试范围
- 蛋白测量为 3 位肝细胞供者、各条件 3 个技术重复；基因调控的转录组采用 JEL，定量 PCR 在 WID 确认；荧光排出试验采用 WID。
- 参照体系
- 同供者新鲜复苏、夹心培养与球状体；鹅去氧胆酸与溶剂；含钙与无钙缓冲液。
- 研究结果
- 多数球状体转运蛋白下降，有机溶质转运体 OST-α/β 与多药耐药相关蛋白 4（MRP4）跨供者平均上升；仍可见 MRP2 相关荧光排出。无钙打开连接后，胆汁内容物部分留在球内，当前方式难以准确量定胆汁排泄指数或清除率。
适用条件与研究局限
- 夹心与球状体采样日不同，培养液和溶剂条件也有差异。
- 某些转运蛋白未正确位于膜上；蛋白含量不直接代表全部转运功能。
- 调控与荧光功能未覆盖全部 3 位供者。
- 部分球内胆汁内容物无法完全清除，细胞内与胆汁腔室含量难以仅凭整体测量区分。
来源与原文
- Evaluation of a human 3D multicellular hepatic spheroid model as a platform for studying hepatic transporters原始研究 · Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS · 2025-12-30