中脑类器官的 6-OHDA 损伤与 MSC 条件培养液测试
在损伤后加入条件培养液，以多标志成像比较神经元和神经突反应。
用途与模型
- 研究用途
- 研究分泌产物对多巴胺能神经元损伤与神经网络形态的影响。
- 模型与细胞来源
- K7、T12、COR 三个健康来源 iPSC 系衍生腹侧神经上皮干细胞，形成第 30 天中脑类器官。
- 方法版本
- 原研究正式发表版本
- 实验形式
- 超低吸附 96 孔聚集；第 8 天 Geltrex 嵌入 24 孔板，每孔 1 个，80 rpm 摇动。
材料与平台
- 模型分化
- 每孔 9,000 个腹侧神经上皮干细胞；第 8 天转入 Geltrex，N2B27 加 200 µM 抗坏血酸、500 µM dbcAMP、BDNF/GDNF 各 10 ng/mL、TGF-β3 1 ng/mL、DAPT 10 µM、Activin A 2.5 ng/mL；每 3 天换液，继续 22 天。
- 条件培养液
- 第 8 代骨髓 MSC 按 5,000 个/cm²扩增 72 小时，PBS 洗 5 次，再用 Neurobasal A 加 1% kanamycin 培养 24 小时收集。上清以 5 kDa 截留装置浓缩 100 倍、-80 °C 保存；体外测试稀释为 1×。
- 损伤与处理
- 第 30 天给 100 µM 6-OHDA 连续 2 天，每 24 小时更新。在不含 B27 和生长因子的 N2 培养液中损伤，移除 6-OHDA 后培养 6 天；比较 1×条件培养液、完整 N2B27 分化液及基础 Neurobasal A，有无损伤各设组。
- 切片和成像
- 4% PFA 室温固定过夜，3% 低熔点琼脂糖包埋，切 80 µm 片，分别采外围和中心；TH、TUJ1、MAP2 及 Hoechst 免疫荧光。Operetta 20×物镜，每片 16–20 区域、25 个 z 层，Matlab 自动分割与形态分析。
测量指标与分析
- TH/TUJ1/MAP2 信号与核信号比
- 神经突碎裂
- 多巴胺能网络连接数
- 网络分支节点数
同一损伤条件下比较 3 种后续培养液；标志信号和神经网络形态分别分析，未损伤组作为相应参照。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 比较 6-OHDA 有无损伤及 3 种后续培养条件。
- 测试范围
- 3 个健康来源细胞系；图 4 定量为 2 次独立实验、每组 24 张切片。
- 参照体系
- 完整分化培养液、基础培养液、MSC 条件培养液，均有对应未损伤条件。
- 研究结果
- MSC 条件培养液减轻损伤后的神经突碎裂，p<0.01；TH 恢复比较 p=0.08，未达到统计显著。
适用条件与研究局限
- 所用系均为健康来源，损伤来自 6-OHDA。
- 每组 24 张切片来自 2 次独立实验，覆盖类器官外围和中心。
- 模型缺少完整小胶质细胞及跨脑区回路。
- 未与患者接受相应治疗后的临床结局比较。